Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Farmacologia Estudo de Bioequivalência de duas formulações de pantoprazol em voluntários sadios de ambos os sexos Aluna: Maria Carla Petrellis Orientador: Prof. Dr. Gilberto De Nucci 2004

Bioequivalência - Considerações Adoção de uma política de medicamentos genéricos Produção Garantia de Qualidade Prescrição Dispensação e uso É parte fundamental das diretrizes para promoção do uso racional de medicamentos em nosso País

Diretrizes da Política de Medicamentos Genéricos (Brasília ,14 de Abril de 1994) alcançar maior racionalidade na utilização de medicamentos estimular a concorrência permitir ao consumidor o acesso de produtos intercambiáveis de diferentes preços

Medicamento Genérico: “ produto farmacêutico intercambiável” Glossário de Termos Especializados para Avaliação de Medicamentos (OMS / OPS -1993) - Geneve Medicamento Genérico: “ produto farmacêutico intercambiável” deve apresentar a mesma segurança, eficácia e qualidade do medicamento de referência produzido após a expiração da proteção patentária ou outros direitos de exclusividade pela DCI (Denominação Comun Inter- nacional), ou seja não apresenta marca

Medicamento de referência eleito pelo Ministério da Saúde Deve conter: o mesmo fármaco a mesma dose posológica a mesma forma farmacêutica e via de administração Medicamento de referência eleito pelo Ministério da Saúde A Equivalência Terapêutica, é assegurada através de Estudos de Bioequivalência A base para a Intercambialidade entre o medicamento de referência e o genérico

Bioequivalência É um estudo comparativo entre as biodisponibilidades de dois medicamentos que possui a mesma indicação terapêutica a mesma via de administração na mesma dose

Medicamentos Bioequivalentes (F.D.A): São equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas que, ao serem administrados: na mesma dose molar, a mesma indicação terapêutica nas mesmas condições experimentais, (mesma via de administração) Não apresentam diferenças estatísticas significantes quanto: à velocidade de absorção à extensão de absorção

Parâmetros para determinar a Bioequivalência ASC (0-t) = Área sob a curva de concentração sangüínea vs tempo Cmax = Pico de concentração plasmática do fármaco t(max) = Tempo para atingir o pico da concentração máxima

Validação de Métodos Bioanalíticos Nas últimas décadas Aumento de métodos bioanalíticos aplicados à cromatografia Determinação qualitativa e quantitativa de fármacos, produtos acabados, matérias primas e amostras biológicas Todas as fases do desenvolvimento do fármaco Pesquisa Estudos de Bioequivalência

Sua importância e suas influências na avaliação Final dos anos 80 Sua importância e suas influências na avaliação e interpretação dos resultados Alvo de amplas discussões presentes em diversas Conferências tanto nos EUA quanto na Europa Fornecer adequadas diretrizes em relação aos parâmetros exigidos na validação analítica

Correta avaliação dos Estudos Biofarmacêuticos Critérios fundamentais empregados, não só em relação a adequada interpretação desses resultados, como também na confiabilidade e no desempenho do método bioanalitico Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, LC-MS/MS) Cromatografia Gasosa (CG, CG-MS/MS) Métodos Imunológicos (RIA, EMIT e ELISA) Metodologias

A Confirmação da especificações pré-determinadas seja encontrada Métodos analíticos devem ser pré-validados na fase de desenvolvimento e também validados durante o ensaio analítico Garantir que os mesmos sejam satisfatoriamente realizados A Confirmação da especificações pré-determinadas seja encontrada Gerar confiabilidade nos resultados obtidos

Os mesmos envolvem procedimentos de determinação e quantificação de moléculas orgânicas com amplas propriedades físico- químicas Cada composto deve ser avaliado de acordo com as suas propriedades individuais Levando em consideração a complexidade analítica As concentrações almejadas

Seleção e Desenvolvimento A etapa crítica no Estudo de Bioequivalência Realização de experimentos Condições necessárias na quantificação do analito em questão Processo de desenvolvimento seja racional e individualizado Requer conhecimentos das propriedades físico-químicas da droga

Validação Total Validação Parcial Para a aplicação deste fato, consideram-se os seguintes tipos de validação: Validação Total Validação Parcial Todos os critérios envolvidos no desenvolvimento analítico deverão ser registrados em relatórios de acompanhamento analítico

As amostras biológicas dos voluntários a processadas em duplicata Protocolo do Ensaio Bioanalítico Manual de procedimentos operacionais padronizados (POPs) Todas as análises do método analítico devem ser submetidas respectivo POP As amostras biológicas dos voluntários a serem investigadas processadas em duplicata uma única lista série de listas analíticas

Parâmetros da Validação Bioanalítica Especificidade - Seletividade Especificidade: o método produz uma única resposta analítica para um único analito Seletividade: a habilidade de uma técnica analítica em distinguir e quantificar, ou não, uma droga em relação a outras resposta de diferentes componentes presentes nos fluidos biológicos

Linearidade* Habilidade de se obter resultados diretamente proporcio- nais à concentração do analito na amostra Fatores na avaliação de curva de calibração: Precisão e exatidão menor ou igual a 15% nas determinações nominais da curva de calibração Precisão e exatidão menor ou igual a 20% nas determinações nominais do LOQ *International Conference of Harmonization - ICH, Guideline for Validation of Analytical Procedure Methodology, 1996; Comissionof European Communities – Comittee for Proprietary Medicinal Products 111/5626/94 final draft, 1994; Buick et al., 1990.

quatro das seis concentrações nominais devem estar de acordo com critérios acima mencionados, incluindo os pontos do LOQ e os pontos de calibração de maior concentração. Valor de coeficiente de correlação linear ou igual ou maior que 0.95

Precisão e Exatidão Exatidão Ruim Exatidão Ruim Precisão Ruim Precisão Boa Exatidão Boa Precisão Ruim Exatidão Boa Precisão Boa

Precisão Grau de concordância entre os resultados de análises individuais, quando o procedimento analítico é aplicado em diversas vezes em uma mesma amostra analítica, em idênticas condições experimentais. Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Causon, R. 1997; Brittain, 1998; Relatório final da IOS (International Organization for Standardization), 1990/1991; Hartmann et al., 1994; Shan et al., 1992; Buick et al.,1990; USPXX 1990; Brooks, 1985 Buick et al., 1990

Repetibilidade (Precisão intra-ensaio): Habilidade de repetições da metodologia empregada nas mesmas condições laboratoriais, considerando um único dia de análise Reprodutibilidade (Precisão inter-ensaio): Habilidade de repetições da mesma metodologia aplicada sob diferentes condições laboratoriais, em subseqüentes ocasiões que podem variar semanas ou até meses

Limite de Quantificação (LOQ) Exatidão Grau de concordância entre os valores individuais encontrados em relação aos valores reais ou nominais Um único dia “ Exatidão Intra-ensaio” Dias diferentes “Exatidão Inter-ensaio” Limite de Quantificação (LOQ) Mais baixa concentração de um composto de investigação que atende os requisitos para precisão e exatidão do ensaio analítico

Deve ser considerada durante a fase do desenvolvimento analítico Recuperação A recuperação avalia a eficiência da extração e sua varia- bilidade. Embora recuperações próximas de 100% sejam desejá- veis, baixas recuperações podem ser utilizadas (50 - 60%) se fo-rem precisas, exatas e reprodutíveis. Estabilidade Deve ser considerada durante a fase do desenvolvimento analítico

Critérios de Aceitabilidade Precisão: Os CV% do inter-day para os QCs é  15%, e  20% para o LOQ QC, avaliados em um mínimo de 3 lotes. Exatidão: A média dos valores do inter-day devem ser menores que 15% do valor nominal dos QCs, e não desviar mais que 20% para LOQ QC. Sensibilidade: O menor ponto da curva de calibração aceitável como limite de quantificação (LOQ) do método é aquele com CV%  20% (inter-day).

Pantoprazol POTENTE INIBIDOR DE LONGA DURAÇÃO DA BOMBA ÁCIDA DA SUPERFÍCIE DAS CÉLULAS PARIETAIS GÁSTRICAS racemic basic and acidic properties white to off-white crystalline powder CH2 N S OCF2H H O OCH3 C16H14F2N3NaO4S P.M= 432.4 Denominação IUPAC: 5-(difluorometoxi-2-(((3,4-dimetoxi-2-piridinil) metil)-sulfinil)-1H-benzimidazol

Justificativa para a seleção do Pantoprazol A transformação induzida pelo ácido da forma pró-droga princípio ativo Pré-requisito geral para o desenvolvimento de novos fármacos com atividade inibitória da bomba protônica (IBPs) Este mecanismo foi descoberto simultaneamente por pesquisadores suecos e da Byk Gulden

Planejar uma entidade química que fosse O objetivo do Grupo de Pesquisa da Byk Gulden Planejar uma entidade química que fosse particularmente mais estável não ativada em pH neutro ou quase neutro

Bomba Protônica inibida OCF2 H CH2 N S H O OCH3 N OCF2H H3CO N+ CH2 s N H+ pH Pantoprazol Sulfonamida cíclica Bomba de Próton - SH N OCF 2 H 3 CO + C s Bomba de Próton Bomba Protônica inibida

Pantoprazole A Cl- HCO3-

Vantagens do Pantoprazol sobre outros IBPs Maior estabilidade em pH pouco ácido Maior seletividade para H+/ K+ ATPase da Célula parietal Menor potencial de desenvolvimento de efeitos adversos Progressos que garantiram alto grau de segurança e eficácia terapêutica

Características Farmacológicas Linearidade da dose Maior segurança e previsibilidade posológica Melhor aproveitamento da dose administrada Eqüipotência da administração oral com a venosa A manutenção da mesma dose oral após suspensão da administração venosa Mínimo risco de interação medicamentosa Mesma apresentação para “bolus” e infusão

Farmacocinética Administração por via oral e endovenosa Ampla biodisponibilidade em média 80% Linear até a dose de 80 mg Alta ligação com as proteínas plasmáticas (98%) Baixo volume de distribuição Curta meia vida de eliminação ± 2hs Metabolismo hepático via citocromo P450 Principal via de eliminação é renal (80%)

Objetivos

Validar a metodologia analítica por LC-MS/MS empregada na quantificação das concentrações de pantoprazol em amostras de plasma humano Avaliar a bioequivalência de duas formulações de pantoprazol baseada na comparação dos valores obtidos dos parâmetros farmacocinéticos de cada formulação calculados a partir de medida das concentrações plasmáticas de pantoprazol

Protocolo do Estudo

Seleção dos Voluntários Vinte e dois voluntários sadios de ambos os sexos Idade entre 18 e 45 anos (média= 30 ± 1 ano) Peso Corporal entre 55 e 100 kg (média 77,5 ± 10,1 kg) Entrevista e exames clínicos pré-estudo Assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido do estudo Protocolo Clínico Aprovado pela Comissão de Ética do Complexo Hospitalar da Universidade Federal do Ceará - COMEPE

Protocolo Clínico Delineamento aleatório cruzado, aberto de dois períodos, com intervalos de 15 dias entre as doses de pantoprazol Hospitalização por 24 horas na Unidade de Farmacologia Clínica Internação seguida de dieta padrão até 23:00 hs Jejum após 23:00hs, e início do estudo clínico às 7:00hs, dose única por via oral de 40 mg de pantoprazol Dieta padrão às 12:00 e às 18:00 hs Restrições: alimentos contendo xantinas

Coleta das amostras Amostras de sangue foram coletadas através de escalpe em veia superficial do antebraço do voluntário Os intervalos de coleta: antes (zero), 0.25, 0.5,0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0, 6.0, 8.0 e 12.0 horas As amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 4000rpm Obtenção do soro e armazenamento na temperatura de - 20°C

Protocolo Analítico Princípio do Método: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de fase-reversa , acoplada a espectrometria de massa (LCMS/MS) Extração Líquido-Líquido com emprego de dietileter:diclorometano (70:30v/v) como solvente extrator

PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÕES Pantoprazol Solução estoque de Pantoprazol (1.0 mg/mL) em metanol: água (50:50) Concentração final de 10 g/mL Carbamazepina (P.I) Solução estoque de carbamazepina (1.0 mg/mL) em metanol: água (50:50) Concentrações finais de 100 g/mL e 1 g/mL

Plasma humano controle solução padrão de pantoprazol PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E AMOSTRAS DE CONTROLE DE QUALIDADE (C.Q.) Curva de calibração Plasma humano controle solução padrão de pantoprazol (10 g/mL) Branco, Branco + PI, 35, 50, 70, 100, 200, 500 e 1000 ng/mL

Plasma humano controle solução padrão de pantoprazol Controle de qualidade Plasma humano controle solução padrão de pantoprazol (10 g/mL) CQA – 120 CQB – 800 CQC – 3000* ng/mL CQC – 600 ng/mL p/ quantificação * fator de diluição 1:5 temperatura de armazenamento - 20 °C

4 mL Dicloromethane (70:30)v/v 37 ºC under nitrogen stream Extraction Procedure 500 µL calibration point, serum sample or C.Q sample + 0.05 mL de carbamazepina (1 g/mL) 4 mL Dicloromethane (70:30)v/v Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream Brief vortex mixing Vortex mixing 30 seconds Centrifuged 2000 rpm 10 min

200 µL of acetonitrile: water (80:20) containing 0.1%(TFA) The residue 200 µL of acetonitrile: water (80:20) containing 0.1%(TFA) Brief vortex mixing Analytical Sample 200 µL

CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E ESPECTROMETRIA DE MASSA Sistema de Cromatografia: Cromatografia Líquida Alta Eficiência de fase - reversa Bomba binária Coluna Cromatográfica: Coluna analítica de fase-reversa :Genesis 4  m C8; 150x4.6 mm diâmetro interno na temperatura de 40 °C Fase Móvel: 80% Acetonitrila – 0.1% ácido trifluoroacético (TFA) – 20% Água Deionizada Fluxo constante: 0.9 mL/min por gradiente isocrático

Eluente: 100L / min analisado no detector MS/MS Injetor Automático: alíquotas de 40L/min na temperatura 10 °C Tempo de Eluição: 4 minutos Tempo de Retenção: Pantoprazol (1.86 min) e Carbamazepina (2.2 min) Detector: O Espectrômetro de massa do tipo Quatro II equipado com “ atmospheric pressure ionization (API) electrspray”, operando de modo positivo (MS+) Pantoprazol : 366.1 > 91.50 , 50V e 35 eV Carbamazepina: 236.9 > 194.2 , 25V e 15 eV

Resultados

Validação Analítica

Figura 1 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Branco (MRM of two channels ES+ 366.10  91.50)

Figura 2 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Lipêmico (MRM of two channels; ES+ 366.10  91.50)

Figura 3 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Hemolisado (MRM of two channels; ES+ 366.10  91.50)

a b Figura 4 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Limite de Quantificação pantoprazol (35 ng/mL), (MRM of two channels; ES+ 366.10  91.50). (B) Padrão interno carbamazepina (50ng/mL), (MRM of two channels; ES+ 236.89  194.09)

a b c Figura 5 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Amostra de um voluntário coletada 5 hs após administração da formulação teste (40 mg de pantoprazol), (MRM: 366.10  91.50). (B) Plasma contaminado com o padrão interno carbamazepina (50 ng/mL), (MRM: 236.89  194.09). (C) Concentração plasmática máxima (99 ng/mL), pantoprazol), (MRM: 366.10  91.50) e seu padrão interno, carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89  194.09)

a b c Figura 6 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Amostra de um voluntário coletada 3 hs após administração da formulação padrão (40mg de pantoprazol), (MRM:366.1091.50). (B) Plasma contaminado com o padrão interno carbamazepina (50ng/mL),(MRM:236.89  194.09).(C)Concentração plasmática máxima (145 ng/mL), pantoprazol), (MRM: 366.10  91.50) e seu padrão interno, carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89  194.09)

a b Figura 7 – Espectro de massa: (A) Espectro do pantoprazol adquirido em Q1, energia do cone = 50v. (B) Espectro dos produtos de íons do pantoprazol adquirido em Q2 após colisão induzido dissociação, energia do cone = 50v e energia de colisão 35eV

a b Figura 8 - Espectro de massa da carbamazepina: (A) Q1= 25v (B) Q2 = 25v / 15eV

Figura 9 – Curva de calibração obtida após a contaminação de plasma humano com pantoprazol (35 – 1000 ng/mL) e carbamazepina (50 ng/mL)

Ensaio da Curva de Calibração Validação do Inter - Ensaio da Curva de Calibração 2 r Concentração 35 50 70 100 200 500 1000 - 1 (ng/mL ) Lote 1 32.3 59.2 70.8 92.4 140.8 505.1 1022.0 0.9900 213.4 497.6 946.2 0.9940 Lote 3 34.2 50.7 68.4 120.9 220.8 528.7 972.9 0.9962 Lote 4 29.8 41.5 66.3 111.7 227.0 526.4 934.2 0.9920 Média 32.8 49.8 70.0 105.2 200.5 515.8 975.9 0.99305 DP 3.7 10.7 6.2 14.8 37.4 33.2 62.5 0.00266 DPR (%) 11.2 21.5 9.0 14 .1 18.6 6.4 EP (%) - 0.2 0.00 5.2 3.1 2.4 Lote 2 33.2 43.8 75.4 105.3 Tabela 1- Validação da Curva de Calibração

Tabela 2- Validação dos Controles de Qualidade *Controle de Qualidade 3000ng/mL foi diluído na proporção de 1:5 para quantificação

Parâmetros Farmacocinéticos

Concentração Média Pantoprazol Pantozol C (ng/mL) Tempo (h) 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 12 75 150 225 300 375 450 Pantoprazol Pantozol Tempo (h) C (ng/mL) Figura 10 - Concentrações plasmáticas (médias aritméticas  EP) de pantoprazol em função do tempo para as duas formulações de pantoprazol (40mg) administradas em 22 voluntários sadios de ambos os sexos.

Tabela 3 – Parâmetros farmacocinéticos de pantoprazol obtidos após a administração de cada uma das formulações de pantoprazol (40mg) nos 22 voluntários.

Tabela 4 – Análise estatística das razões individuais teste/referência da ASC 0-12h, ASC0-, Cmax, e das diferenças teste – referência de Tmax entre ambas as formulações de pantopra- zol. bMédia Aritmética das diferenças individuais c90% das diferenças individuais

Conclusão

Estão dentro dos critérios de aceitabilidade para validação analítica Os valores para a precisão e exatidão do inter- ensaio: Linearidade Controles de Qualidade Estão dentro dos critérios de aceitabilidade para validação analítica Concluímos que a metodologia empregada apresentou valores aceitáveis para a validação dentro das exigências presentes nos guias dos Órgãos Oficiais de Saúde

Totalmente incluídos dentro da faixa de bioequivalência Os valores das médias das razões individuais dos parâmetros farmacocinéticos: ASC (0-12), ASC (0- ), Cmáx e Cmáx / ASC(0-12) Totalmente incluídos dentro da faixa de bioequivalência (80-125%) As diferenças individuais de tmáx são estatisticamente diferentes de zero como mostrado pelos intervalos de confiança de 90%

Concluímos que a formulação teste Pantoprazol é bioequivalente à formulação referência Pantozol tanto quanto para velocidade quanto para extensão de absorção