ELISA Um dos métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar antígenos e anticorpos, apresenta grande sensibilidade e especificidade, tornou-se uma das técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas mais utilizadas.

ELISA uma enzima que está ligada ao Ac que formou um imunocomplexo com seu respectivo Ag, reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido. Se o Ag estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. A presença de produto colorido indica que o Ac encontrou e se ligou ao Ag. É um método eficiente pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g).

ELISA O ELISA constitui a base do teste para infecção por HIV e diversos outros diagnósticos por sorologia. Nesse teste, proteínas virais (Ag) são adsorvidas aos “poços” (wells) da placa de ELISA. Em seguida, é adicionado soro do paciente, que se contiver Ac, estes se ligarão aos Ag. Finalmente, Ac marcados com uma enzima ligam-se aos Ac humanos (complexo Ag-Ac), propiciando a reação enzimática com mudança de cor.

ELISA Indireto

ELISA http://www.positivehealth.com/permit/Articles/Colon%20Health/abraham62.htm http://www.callisto.si.usherb.ca:8080/iml302/images/elisa3.jpg

ELISA Sanduíche O Ac contra um Ag particular é adsorvido no well. Depois, o Ag (soro, urina ou outra amostra) é adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente Ac ligado à enzima é adicionado. Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional à quantidade de Ag presente. Logo, permite mensurar até pequenas quantidades de antígeno.

ELISA Sanduíche [After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162.]

ELISA EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS: PLACA DE ELISA (material permite adsorção do Ag ou Ac e tem fundo chato, podem ter tiras removíveis).

ELISA Micropipetas (comuns ou multicanal) http://pandora.labgeminis.com:8909/images/8x200_ul.jpg http://www.jaelsa.com/imagenes/pipeta1.jpg

ELISA Lavador de placas:

ELISA Leitor de Elisa (espectrofotometro p/ placas) Leitor de tiras ELISA http://www.rclcomercial.com.br/drake/i004.jpg

ELISA PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE: Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o primeiro Ac com concentração conhecida e suficiente para adsorver nos “poços” (“wells”) da placa. Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa. Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular, como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de bloquear as áreas onde os anticorpos não aderiram na placa (sítios inespecíficos). Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAÇÃO da placa está cumprida.

ELISA Incubação com as amostras (soluções teste com Ag em concentração desconhecida devem ser adicionadas à placa) Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o anticorpo previamente aderido à placa também permanecerá aderido. Por outro lado, os antígenos não ligados serão removidos. Incubação com segundo anticorpo, seguida de lavagem. Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a uma enzima, como a peroxidase. Segue-se outra lavagem.

ELISA Adição de substrato para revelação. É um substrato incolor que, quando ativado pela enzima ligada ao sistema Ac-Ag, produz um produto final corado. A mudança de cor pode ser lida diretamente em aparelho apropriado. Em geral, bloqueia-se a reação para evitar que o produto final fique muito escuro e atrapalhe a leitura do teste. Além de bloquear a reação, é possível adicionar um ácido que provoque mudança para uma cor cuja absorbância é melhor detectada pelo leitor de ELISA. 1O ANTICORPO 2O ANTICORPO ANTÍGENO DA AMOSTRA ANTICORPO LIGADO MUDANÇA DE COR

ELISA Leitura placa http://www.netria.co.uk/images/elisa2.jpg

EXEMPLO DE CURVA PADRÃO ELISA - Curva padrão CURVA PADRÃO, preenchendo 8 “poços” de uma fileira com concentrações crescentes e conhecidas de antígeno. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-testes. O gráfico é fornecido por um programa próprio para a leitura de ELISA. EXEMPLO DE CURVA PADRÃO

ELISA - Controles Um outro controle feito é o TESTE BRANCO, que consiste na adição somente do tampão com o objetivo de avaliar se houve contaminação durante o experimento. O teste deve ser feito em DUPLICATA ou TRIPLICATA, servindo de controle para os erros de manuseio. A média dos resultados deve ser avaliada e se houver diferença significativa, o experimento deve ser repetido. PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: se a amostra for sangue, deve-se centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir e analisar. Células em cultura devem ser trituradas, o tampão deve ter pH adequado, substância detergente (para lisar a membrana) e inibidores de proteases. Depois, centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para análise.

Hemaglutinação Indireta - HAI ex: Diagnóstico de Chagas A doença de Chagas é causada por um protozoário o Trypanosoma cruzi, e transmitida ao homem por um inseto, o triatomíneo. Imunologicamente, 3 estágios podem ser considerados: agudo, latente ou indeterminado e crônico. Na fase intermediária ou latente não há sintomas, as informações prestadas pelo laboratório clínico tornam-se decisivas no diagnóstico etiológico. Reação de hemaglutinação indireta (HAI) Princípio do método: Eritrócitos de aves sensibilizados com componentes antigênicos do T. cruzi, altamente purificados, mostram aglutinação quando reagem com Ac contra esses antígenos presentes no soro do paciente.

HEMAGLUTINAÇÃO Procedimento Pipetar 50 microlitros do soro controle positivo, negativo e de cada amostra nas respectivas cavidades da placa. Adicionar 25 microlitros da suspensão homogênea de hemácias em cada cavidade. Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placas) ou batendo, com os dedos, nas bordas da placa por 3 a 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente,em local livre de vibrações (IMPORTANTE). Fazer leitura.

HEMAGLUTINAÇÃO EM Placa LEITURA NEGATIVO: quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade formando um botão. POSITIVO: quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, as vezes com bordas irregulares. Os soros que mostram reação positiva no teste qualitativo devem ser titulados.