Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos Profa. Dra. Rejane da Silva Sena Barcelos.

Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos Eletroforese em gel  Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente. Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel. A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.

Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos A análise de DNA por eletroforese é uma das técnicas fundamentais nos laboratórios de pesquisa e de diagnóstico. O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo (anôdo). A velocidade da migração depende do tamanho da molécula. Por isso em um dado momento da eletroforese moléculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz.

Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos Matriz - agarose ou poliacrilamida – Depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes: Gel de agarose para a separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) Gel de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos, de até 1kb.

Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos CUIDADOS: Poliacrilamida em solução - neurotóxica. A preparação do gel exige certa cautela. É mais laboriosa, requerendo a mistura de componentes adicionais à poliacrilamida para ajudar na polimerização e mais tempo para que a polimerização ocorra.

Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos CUIDADOS: Agarose - mistura de um tampão e agarose, não tóxica. Polimerização é mais rápida e o gel pode ser reciclado após o uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração de outros géis. Usado como método analítico ou preparativo, isto é, quando o fragmento de DNA é recuperado e purificado a partir do gel.

Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos CUIDADOS: Agarose - Desvantagem: Coloração com brometo de etídio (EtBr) - substância mutagênica. É necessária a utilização de transiluminador de luz ultravioleta.

Gel de Agarose Solução Tampão Pente Poço Gel agarose

Gel de Agarose

Gel de Agarose Agarose É um polissacarídeo extraído de algas marinhas, formado por resíduos de D e L galactose unidos por ligações glicosídicas α (1-3) e β (1-4), é um material gelatinoso e semelhante a gelatina incolor. Forma uma rede que segura as moléculas durante a migração. Separa moléculas com diâmetro igual ou superior a 10 nm.

Gel de Agarose Rede é formada pela solidificação de um polímero linear com filamentos finos entrelaçados Agarose: Colóide natural

Gel de Agarose A agarose é dissolvida em água fervendo e forma um gel quando esfria. Formação de duplas hélices que se juntam lateralmente.

Gel de Agarose

Gel de Agarose Um fragmento de DNA possui uma mobilidade eletroforética que decresce em proporção ao logaritmo do seu tamanho em pares de bases. Fragmentos maiores movem-se mais lentamente. Essa proporcionalidade depende: - concentração do gel de agarose - composição do tampão de corrida - condições eletroforéticas Diferentes concentrações de agarose permitem uma separação eficiente de diferentes tamanhos de DNA.

Gel de Agarose Tamanho dos poros do gel de agarose: diretamente proporcional ao tamanho do fragmento que se deseja separar. O tamanho do poro, ou a porosidade do gel é definido pela concentração do gel. Quanto menor for a concentração do gel maior será a porosidade e, portanto, maior o fragmento de DNA que poderá ser separado Quanto menor a concentração do gel, mais frágil ele se torna. Geralmente se trabalha com géis de agarose de 1 a 1,5%, dependendo do fragmento de DNA esperado.

Gel de Agarose Concentração: dada como peso de agarose por volume de água. Géis a 1%: poros em torno de 150 nm Géis a 0,16%: poros em torno de 500 nm

Fatores que afetam a migração Tamanho da molécula Concentração do gel Define o tamanho dos poros Conformação do DNA Força elétrica aplicada Voltagem (Volts) Corrente (Ampéres) Força (Watts) Presença de corantes intercalantes Composição do tampão

Gel de Agarose SOLUÇÕES E REAGENTES Tipos de tampões: a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA) b) TPE (Tris-phosphate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA) c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDTA)

Gel de Agarose Tampão de carregamento (loading buffer): Misturado às amostras antes de aplicar no gel. Finalidades: 1) Aumentar a densidade da amostra 2) Adicionar cor às amostras Coloração do gel: Brometo de etídeo (agarose e poliacrilamida)

Aplicação das amostras: Antes da aplicação, as amostras de DNA deverão ser misturadas a um tampão de amostra. Contém corantes e reagentes de alta densidade (sacarose, glicerol ou ficol). Asseguram que a amostra de DNA entre no poço pela força da gravidade. Corantes azul de bromofenol e o xileno cianol, facilitam a aplicação da amostra no gel (acrescentam cor na amostra) e auxiliam no monitoramento da corrida, já que apresentam velocidade conhecida durante a migração na matriz em direção ao pólo positivo.

Tamanho dos fragmentos Estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA é necessário aplicar em um dos poços o marcador de massa molecular (ladder). Ladder é uma mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos e concentrações conhecidos, gerados a partir da digestão de plasmídeos (DNA circular - bactérias) com enzimas de restrição. Permite inferir, por comparação, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada. Ladder 1kb -13 fragmentos (0,3 a 10 kb) Ladder 100bp -14 fragmentos (0,1 a 5 kb)

Gel de Agarose Corantes: EtBr - brometo de etídeo Intercala-se com a molécula de DNA a cada 2,5 bp do fragmento. Após sua inserção esse exerce uma ligação do tipo van der Waals. Radiação UV - capaz de estimular essa ligação entre o DNA e o corante tornando a banda visível no gel através de um dispositivo de transiluminação. Brometo de etídeo é mutagênico!!!

Gel de Agarose EtBr - brometo de etídeo A intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra. Pode ser utilizado de 3 diferentes formas: - aplicado diretamente no gel - no tampão da amostra - após a corrida quando o gel é submergido em solução de EtBr. EtBr - brometo de etídeo

Transiluminador VDS

Gel de Agarose

Gel de Agarose Corantes: SYBR Green I Corante intercalante que pode detectar até 20pg de DNA-dupla fita Brometo: 1 a 10 ng de DNA, no mínimo, para dar sinal fluorescente Sensibilidade 50 a 100 vezes maior que o brometo Menos mutagênico

Gel de Agarose SYBR Green I

Gel de Poliacrilamida Separação de moléculas e DNA. Forma uma malha com poros que permite a passagem das moléculas e sua separação de acordo com suas características. A poliacrilamida é uma mistura de polímeros, acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto a bisacrilamida tem forma de "T". Misturando essas duas moléculas, temos a formação de uma "rede". Diferentes concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação.

Gel de Poliacrilamida Preparo gel de poliacrilamida: misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações desejadas, colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como catalizadores da polimerização.