Sequenciamento de DNA 1977 Max & Gilbert (Harvard – USA) Fred Sanger (Cambridge – Inglaterra) Método para determinar a sequência de nucleotídeos em um fragmento de DNA pela síntese dessa molécula in vitro

Método de Sanger (enzimático ou de terminação de cadeia) DNA em fita simples (molde) Primer (iniciador da síntese) Desoxinucleotídeos (dNTP – A, T, G, C – marcados radioativamente) Dideoxinucleotídeo (ddNTP) Enzima polimerase

Componentes do sequenciamento Desoxi Permite extensão da fita no final 3’ Previne a extensão da fita no final 3’ rribonucleosídeo trifosfato didesoxi HHHH H

Método enzimático para sequenciamento de DNA (Sanger e col., 1977) 5’ 3’ DNA fita dupla GCATATGTCAGTCCAG 3’ 5’ CGTATACAGTCAGGTC DNA fita simples 3’ 5’ CGTATACAGTCAGGTC 5’ 3’ Iniciador GCAT + DNA polimerase + excesso de dATP, dTTP, dGTP, dCTP +ddATP +ddTTP +ddCTP +ddGTP GCAT A GCAT AT GCAT ATGTC GCAT ATG GCAT ATGTCA GCAT ATGT GCAT ATGTCAGTC GCAT ATGTCAG GCAT ATGTCAGTCCA GCAT ATGTCAGT GCAT ATGTCAGTCC GCAT ATGTCAGTCCAG

Método de sequenciamento enzimático (manual)

Método enzimático para sequenciamento de DNA (Sanger e col., 1977) 3’ G A C T A T C G 5’

G A C T G T C A C G His  Gln Sequenciamento direto de DNA (gene a2) de portador da Hb Westmead (a122 HisGln)

Sequenciamento automático Permite a análise simultânea de diversos segmentos de DNA Utilizado para sequenciamento de larga escala Nucleotídeos marcados com fluorocromo (quatro corantes diferentes) Emitem luz em diferentes comprimentos de ondas quando excitados por um laser

Sequenciamento automático de DNA DNA de fita simples com o inserto clonado a ser sequenciado Adição de constituintes das reações de sequenciamento Sequenciamento automático de DNA Terminadores didesoxi Primer universal do M13 com marcador fluorescente Fitas de DNA sintetizado marcadas Mistura das quatro reações Processamento dos por um computador Excitação do marcador fluorescente com laser Detecção com fotomultiplicador

Sequenciamento de DNA automático 5’ 3’ DNA fita dupla GCATATGAG 3’ 5’ CGTATACTC ddATP ddCTP ddTTP ddGTP Terminadores dideoxi + + + + Primer com marcadores fluorescentes GCAT GCAT GCAT GCAT CGTATACTC CGTATACTC CGTATACTC CGTATACTC

Sequenciamento de DNA automático Mistura das 4 reações de sequenciamento Resultados processados em um computador Fotomultiplicador Laser Gel de sequenciamento

Timina Adenina Guanina Citosina

Sequenciamento de DNA C T G A

1 2 3 4 GA nt 30.864, aa248, Arg  Gln CGA  CAA

1 2 G (normal) 1 2 3 4 1

1 2 3 4 G/A (heterozigota) R