Outros testes de sensibilidade a antifúngicos

Apresentação em tema: "Outros testes de sensibilidade a antifúngicos"— Transcrição da apresentação:

1 Outros testes de sensibilidade a antifúngicos
Dra. Márcia Melhem Seção de Micologia Instituto Adolfo Lutz

2 índice índice sair Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos
Quando avaliar a resistência a antifúngicos Isolamento de um fungo Como realizar os testes Testes Problemas ainda existentes no método de referência... Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc Interpretação dos resultados de MIC (g/mL) Sensititre YeastOne Resultado SDD Comparação de métodos Indicações do teste de sensibilidade Espécies Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade Considerações finais índice índice sair

3 Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos
sair índice Difusão a partir de discos Difusão a partir de fitas Diluição em agar Diluição em meio líquido em tubos = macrodiluição em placas = microdiluição

4 Quando avaliar a resistência a antifúngicos?
sair índice Infecção ou colonização? Critérios microbiológicos e clínicos para indicação do teste de sensibilidade a antifúngicos

5 Isolamento de um fungo sair índice Fungo Filamentoso (bolor) Levedura

6 índice sair Microbiota humana transiente ou permanente
(pele, mucosas, TR, TGI, TU) + MEIO AMBIENTE Microbiota transiente (pele, mucosas, TR) + MEIO AMBIENTE

7 Como realizar os testes?
sair índice Colônia pura Manutenção Freezer a °c Cultura mista é uma causa comum de erro! Plaqueamento

8 índice sair Como realizar os testes? 1.Inóculo = INÓCULO
Suspensãode células do fungo = INÓCULO Comparação para ajuste de turbidez: espectrofotômetro ou visual Solução-padrão= 106 ufc/mL

9 índice sair Como realizar os testes? 2. Condições INÓCULO X
ANTIFÚNGICO (s) = Sensibilidade CONDIÇÕES PARA O TESTE: temperatura, tempo e meio de cultura Meio Sólido (agar) Meio Líquido (caldo)

10 Método de Difusão por Discos
sair índice ... técnicas em agar Vantagens Parâmetros definidos para Candida e FZ (M44P) Fácil de realizar Similaridade com antibiograma Desvantagens Falta padronização para outras drogas Resultado somente em 3 categorias que não indicam pequenas alterações ou tendência para ® Não fornece a concentração inibitória mínima (MIC), apenas correlaciona MIC com diâmetro do halo

11 Método de difusão por fitas
sair índice ... técnicas em agar Vantagens: Resultado em CIM = MIC Facilidade de execução Disponível no comércio Desvantagens: Produto importado (custo) Trailling Leitura subjetiva Inóculo variável

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13 índice sair Técnicas em agar
Diluição em ágar Diversas placas, cada uma contendo agar com diferentes concentrações de um AFG Inóculo na superfície (fungos de crescimento lento, dermatófitos, agentes de cromomicose) Observa-se a inibição do fungo na CIM (Vantagem sobre técnica de disco) fungo Placa com agar e afg ,5 (g/mL)

14 Variante do teste em placa: Teste Rápido para leveduras frente a FZ
sair índice Agar com FZ (8g/mL) Colônias pequenas: sensíveis Colônias grandes: resistentes Mas, requer ainda melhor avaliação com cepas R

15 índice sair Testes em meio líquido
Em tubos = macrodiluição ou macrométodo Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo Método de Referência para leveduras (Candida spp e Cryptococcus neoformans) Doc. M27-A, NCCLS Método de Referência para Fungos Filamentosos (Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e Scedosporium) Doc. M38-P, NCCLS

16 índice sair Macrométodo
Série de 10 tubos com várias concentrações do antifúngico + inóculo do fungo Após 24 a 72 h observa-se os tubos em que houve inibição de crescimento Entre esses tubos, o que contém a menor concentração corresponde ao MIC

17 CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO
Micrométodo em placa sair índice CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO INÓCULOS Inóculos cepas ATCC Controle de esterilidade do meio MIC Controle de crescimento dos inóculos

18 índice sair Micrométodo em placa Automatização = resultados acurados
Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes Placas contendo [FZ] de 0,12 até 64g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8g/mL= armazenadas e congeladas, prontas para uso Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d.o.impressa em fita = rastreabilidade de resultados Determinação do MIC: Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing  MIC é concentração que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12) Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento

19 sair índice Micrométodo em placa

20 Vantagens: acurácia (procedimento e leitura)
sair índice

21 sair índice Problemas ainda existentes no método de referência...

22 Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc
sair índice AB 100% de inibição (NCCLS) 90% (EUCAST) 16 µg/ml , , C+ CIM Azóis 80% Inibição (MACRO) 50% de inibição (MICRO) 64 µg/ml , , C+ CIM

23 E ainda... sair índice Método tem baixa sensibilidade p/ identificar cepas resistentes à anfotericina B - AMB. Não é viável para laboratório de análises clínicas (complexidade e custo). Algumas espécies de leveduras não crescem bem nas condições de incubação (T , t, meio de cultura?) Outros métodos denominados NCCLS-like : Europa: comitê da ESCMID = EUCAST (modificações na microdiluição: adição de glicose ao meio de cultura, suspensão mais concentrada do fungo, leitura antecipada, agitação das placas, etc...).

24 Interpretação dos resultados de MIC (g/mL)
sair índice Afg S SDD R FZ < 8 > 64 IZ < 0,25 0,25-0,5 > 1 AMB < 2 - > 2 NCCLS 2002 S = sensível; R = resistente; SDD = sensibilidade dependente da dose: 100 mg/dia= 6-7 ug/mL de soro FZ mg/dia= 20 ug/mL de soro 800 mg/mL=50-60 ug/mL de soro

25 índice sair Sensititre YeastOne
Indicador Alamar Blue (oxidação-redução) 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC Película selante. Incubação 35°C/24h – 48h Crescimento: negativo inibição parcial ( trailing) positivo

26 Dose diária de FZ (mg/dia) Concentração sanguínea (g/mL)
Resultado SDD sair índice Concentrações séricas de FCZ Dose diária de FZ (mg/dia) Concentração sanguínea (g/mL) 100 6 400 20-30 800 40-60

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28 índice sair Comparação de métodos 5 cepas ATCC Correlação boa:
[Ramani & ChatuRverdi JCM 2003;41] 5 cepas ATCC Correlação boa: AMB = 85 % FZ = 74 % Maiores erros: Apenas 1/17 indicou C.krusei FZ® Nenhum indicou C.lusitaniae AMB® 17 laboratórios de Nova York, USA E-test (3/17) Microdiluição (14/17)

29 235 cepas de Candida glabrata E-test com azul de metileno
Comparação de métodos sair índice 235 cepas de Candida glabrata E-test com azul de metileno Difusão por discos Microdiluição FZ = 91-96% VZ = 93-95% Pfaller et al., 2003 726 cepas de Candida sp E-test Microdiluição Caspofungina = alta correlação, exceção C.lusitaniae Pfaller et al., 2002

30 índice sair Comparação de métodos E-test Microdiluição
102 cepas Candida spp e Saccharomyces cerevisiae E-test Microdiluição Correlação E test x NCCLS VZ = 100% Correlação E test x NCCLS Caspofungina = 89% Chryssanthou, E & Cuenca-Estrella JCM 2002;40

31 Indicações do teste de sensibilidade
sair índice Critério microbiológico: depende da identificação da espécie

32 Após a identificação da espécie....
sair índice Espécie reconhecidamente, resistente ® aos azóis ou anfotericina B Espécie sensível

33 índice sair Espécies: 3 tipos ® ® INTRÍNSECA: todos os membros são ®
Ex.: fungos filamentosos e levedura Candida krusei frente ao fluconazol (FZ) Há indicação do teste de sensibilidade ao FZ ? não E para outros azóis? sim

34 índice sair Espécies ® ® NATURAL: alguns membros são ®
Ex.: Candida glabrata ao FZ C.lusitaniae, Aspergillus, Rhizopus à anfot.B (AMB) Há indicação do teste de sensibilidade ? sim

35 Espécies ® sair índice ® ADQUIRIDA: após exposição à droga, alguns membros, ou todos, tornam-se ® Ex.: C.glabrata,C.albicans,C.parapsilosis, C.tropicalis e outras espécies a FZ, itraconazol e cetoconazol Há indicação do teste de sensibilidade ? sim

36 índice sair Candida glabrata
Desenvolve ® de modo muito rápido, poucas horas de exposição ao FZ. Não se recomenda tratar infecções caudadas por C.glabrata com FZ.

37 Espécies reconhecidamente, sensíveis
sair índice Avaliação da sensibilidade in vitro não precisa ser feita de rotina, para a orientação terapêutica. A identificação da espécie, em regra, é suficiente para manter ou re-orientar tratamento.

38 Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade
sair índice Paciente com histria de profilaxia com azól. Caso de falha terapêutica. Caso com infecção por espécie com perfil de sensibilidade desconhecido ou pouco estudado.

39 índice sair Considerações finais
Testes em agar podem ser úteis para triagem de cepas resistentes, desde que, realizadas dentro de um protocolo rígido, com cepas-padrões e monitorados por um laboratório de referência (método NCCLS ou NCCLS-like). Os métodos de referência não são aplicáveis a todas as espécies de fungos. Não existe um método com boa sensibilidade para identificar cepas AMB ®. A aplicação clínica de testes de sensibilidade a antifúngicos é limitada.