ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais

Apresentação em tema: "ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais"— Transcrição da apresentação:

1 ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais
BIOMEDICINA FIEL DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO

2 Reações imunoquímicas
Reação - ANTÍGENO + ANTICORPO – princípio básico: detecção deste complexo Reação química especial Reconhecimento do antígeno (depende do tipo de antígeno a ser pesquisado)) Superfície da célula Disperso em solução Parâmetros que dependem do Anticorpo Utilizado Sensibilidade (anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de anticorpo) Especificidade anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de anticorpo) Afinidade Avidez Diversidade

3 Classificação dos Imunoensaios

4 Reações de Precipitação
QUANTIFICAÇÃO dos complexos formados pela reação Antígeno+anticorpo que se precipitam no meio. Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos componentes: FENÔMENO PR0-ZONA Desnecessária separação do complexo antígeno+anticorpo (fase ligada) das substâncias livres no meio COMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO pode ser quantificado: visualmente a olho nu visualmente usando um microscópio por medida da turbidez (turbidimetria) quantificado por nefelometria

5 Reações de Precipitação
Fatores interferentes: Concentrações do antígeno e do anticorpo presentes no “sistema” (amostra+reagente) Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH) Precipitação máxima: concentrações equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac) Sensibilidade: 10 microgramas/mL

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8 Reações de Precipitação Direta Clássica
triagem inicial p/ SÍFILIS OU LUES VDRL – Venereal Desease Research Laboratory RPR – Reagina Plasmática Rápida RPS - Reagina Para Sífilis medido nestas reações: presença de anticorpos para o material lipoproteico das células danificadas pela doença. presença de anticorpos para a cardiolipina dos Treponemas Métodos não treponêmicos e INESPECÍFICOS Sensibilidade: 78% na fase primária (74 a 87%) 100% na fase secundária 95% na fase latente (88 a 100%) 71% na fase tardia (37 a 94%)

9 Reações de Precipitação DERIVADAS
MANUAIS Imunodifusão Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese) Imunofixação Eletroimunodifusáo UTILIZADAS EM LABORATÓRIOS DE PESQUISA AUTOMATIZADAS NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA UTILIZADAS EM GRANDES LABORATÓRIOS

10 Nefelometria e Turbidimetria
Possibilidade de Automação total Nefelômetros Equipamentos de bioquímica (turbidimetria) Dosagem de proteínas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR) Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína) Fator Reumatóide Microalbumina Proteína C Reativa Apoliproproteína inúmeras outras substâncias (imunoglobulinas, transferrina etc)

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13 Reações de Aglutinação
Formação de agregados grandes de partículas com múltiplos determinantes antigênicos interligados por pontes moleculares de anticorpos; Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes partículas Detectam tanto a presença de IgM quanto de IgG Visualização: depende do tamanho dos agregados formados Pode ser realizadas em placas, tubos ou lâminas:

14 Reações de Aglutinação Fatores interferentes:
Classe do Anticorpo envolvido; Eletrólitos; Macromoléculas Hidrofílicas; Enzimas; pH (6 a 8); Tempo; Temperatura

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16 Falso Negativas Quantidade pequena de anticorpos:
a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a sua superfície (sensibilizada), não formando pontes e não aglutinando; Quantidade muito grande de anticorpos (fenômeno Pró-zona)

17 TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS
Determinantes antigênicos Naturais: Eritrócitos humanos – determinação grupo sangüíneo ABO Bactérias – SLIDEX meningites Protozoários Partículas inertes revestidas Látex (mais comum) – teste de gravidez Gelatina Betonita, polipeptídeos Células antigenicamente não relacionadas Células revestidas com antígenos solúveis: ou com antígenos solúveis adsorvidos ou fixados Hemácias e bactérias

18 Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas
Aglutinação direta : ex teste de gravidez Aglutinação passiva Hemaglutinação direta: ABO RH Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose Hemaglutinação Passiva Inibição de Hemaglutinação Inibição de Hemaglutinação passiva

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21 Imunofluorescência Manual 1
Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antígeno. Reagentes Utilizados: Anticorpos Marcados (Fluocromos – Isotiocianato de Fluoresceína* ) Glicerina Alcalina Corantes (Azul de Evans)

22 Imunofluorescência Manual 2 - DIRETA
A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência Pesquisa de antígeno • amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a substância fluorescente (conjugado)* microscópio de fluorescência

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24 Imunofluorescência Manual 3 – IFI - INDIRETA
A- pesquisa de antígeno • amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac * • Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * • microscópio de fluorescência • * lavagens B- pesquisa de anticorpos • Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac * • determinação do título e classe do Ac

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27 IMUNO-ENSAIOS QUANTITATIVOS classificação tipo de reação (cinética)
COMPETITIVOS Há competição entre a substância presente na amostra (ou o padrão) e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos específicos – variante: Radioimunoensaio (RIA). NÃO COMPETITIVOS: São utilizados dois anticorpos, um ligado à fase sólida e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutível, e possui níveis de sensibilidadeanalítica superiores. Desvantagem, precisam ter dois epítodos. Variante: Imunométrico

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29 Competitivo ou não Competitivo: Não Competitivo
Quanto maior a concentração do analito menor a contagem do sinal Amostras positivas tem leitura abaixo do valor limiar ou “cut-off” Não Competitivo Quanto maior a concentração do analito maior a contagem do sinal Amostras positivas tem leitura acima do valor limiar ou “cut-off”

30 IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:
COMPETITIVOS anticorpo primário na fase sólida – (pag 963) e antígeno marcado anticorpo secundário na fase sólida – (pag 964) e antígeno marcado NÃO COMPETITIVOS SEQUENCIAL SANDUÍCHE

31 IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: CLASSIFICAÇÃO TIPOS / SIGLAS
Marcador radioativo: Radioimunoensaio (RIE) Imunorradiométrico (IRMA) Marcador enzimático Enzimaimunoensaio (EIA) ELISA - Ensaio imunoenzimático MEIA - Ensaio imunoenzimático de micropartículas Marcador FLUORESCENTE Imunofluorométrico (IFMA) FPIA – Fluorescence polarization immunoassay ELFA - Enzyme Linked Fluorescent Assay Marcador QUIMIOLUMINESCENTE Quimioluminescência convencional EQL, Eletroquimioluminescência (ECLIA) Ensaio imunológico quimioluminescente magnético CMIA

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33 IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:
Fatores Interferentes: Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais. Presença de Anticorpos Heterófilos: Resultados falso positivos ou altos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais

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35 IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS Fatores interferentes II
Contagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligação inespecífica de constituintes do soro ao suporte sólido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade. Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificação de substâncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligação.

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37 Ensaios com marcadores RADIOATIVOS – RIA, RIE, IRMA
pouco usado na rotina: exige profissional com credenciamento na CNEN (curso de seis meses em São Paulo) um dos componentes do sistema é marcado com isótopo radioativo ensaios competitivos : o reagente marcado é = à substância que se quer dosar (antígeno) (RIA/RIE) ensaios não competitivos: o reagente marcado é um segundo anticorpo (IRMA) O radioisótopo mais utilizado é o I125 (57,5 dias)

38 Ensaios com marcadores ENZIMÁTICOS – EIA, ELISA, MEIA, ELFA
EIA – Enzyme Imunoassay - Ensaio imunoenzimático ELISA - Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay MEIA – Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas ELFA – Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-enzimático fluorescente

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40 ETAPAS ELISA, EIA sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag ou do Ac bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) * adição da amostra (em diluente) * adição do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) * adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) interrupção da reação: SDS ou ácido forte leitura: leitor de ELISA * lavagens

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43 EIA – ELISA Vantagens e Desvantagens
Sensibilidade, especificidade e simplicidade da técnica; Cuidados com interferentes, reações cruzadas Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura; Erros operacionais, variáveis analíticas Adaptação a diferentes graus de automação Instabilidade dos reagentes Influência em manipulações e do equipamento

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46 Ensaios com marcadores FLUORESCENTES – MEIA, ELFA, FPIA
MEIA – Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas (detecção é fluorescente – Axsym) (ABBOTT) ELFA – Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-enzimático fluorescente IFMA: Immuno FluoroMetric Assay ou ensaio Imunofluorométrico FPIA: Fluorescence Polarization ImmunoAssay

47 Ensaios com marcadores FLUORESCENTES
Utilizam enzimas com substratos Fluorescentes Utilizam aparelhos denominados de Fluorômetros; As técnicas diferem quanto ao suporte sólido As técnicas diferem também á forma de ampliar o sinal; Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; FPIA Possui sensibilidade e especificidades elevadas; Bom método para dosagens hormonais

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49 QUIMIOLUMINESCÊNCIA I
Reação entre o Ag/Ac, marcada com fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato Quimioluminescente gerando um produto instável o qual após estabilização gera emissão de fótons de luz medida por FM, que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos(CPS). São reações de oxidação ►luz no espectro visível;

50 QUIMIOLUMINESCÊNCIA II
A sensibilidade de um método enzimático aument cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromogênico por um luminescente; É a emissão de luz produzida em algumas reações químicas envolvendo moléculas que emitem luz, quando passam do estado de excitação para o basal eletrônico; São altamente sensíveis; Método de escolha para quantificação de substâncias, como hormônios e marcadores tumorais.

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56 QUIMIOLUMINESCÊNCIA Pra que serve??? Qual vantagem?
UTILIDADES: Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3, CA-19-9, CEA, AFP) HORMÔNIOS DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites, VITAMINAS DOSAGEM DE IGE TOTAL HOMOCISTEÍNA VANTAGENS: Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato cromogênico por um luminescente