Estratégias para purificação de uma proteína

Apresentação em tema: "Estratégias para purificação de uma proteína"— Transcrição da apresentação:

1 Estratégias para purificação de uma proteína
BIO Biofísica de Proteínas Regente: Célia R. Carlini Estratégias para purificação de uma proteína Os assuntos abordados nessa aula são: Métodos de centrifugação e precipitação diferencial Dosagem de proteínas Métodos cromatográficos Análise de eficiência da purificação Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações

2 Principais componentes moleculares da bactéria E. coli
Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total H2O Proteínas Ac. Nucléico DNA e RNA Carbohidratos Lipídeos Outros Íons Mol. Monoméricas - 500 A tabela acima mostra a percentagem em peso dos principais tipos de moléculas presentes em uma célula simples, a bactéria Escherichia coli. Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas. Como são as proteínas que executam a maior parte das funções vitais de um organismo, uma grande parte das questões na Biologia envolve conhecer em detalhes a estrutura 3D e o funcionamento de uma proteína. Para se obter uma proteína em particular, é necessário separá-la de todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica.

3 Métodos de Isolamento de Biomoléculas
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez. Métodos de purificação 1 proteína isolada Proteínas de uma célula

4 Métodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis. Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias: Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas: 1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

5 . . . . . . 1 Proteína apenas MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
ORGANELAS Lisossomos Mitocôndria Golgi Núcleo SOBRENADANTE F 1 2 3 4 .1 .2 .3 .3.1 .3.2 2. 3.N Precipitação com Sal/Solvente Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) .3.N.X 1 Proteína apenas (0.001g) a 0.5% total Gel Filtração MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente numa mistura complexa. Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas. Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequente-mente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura.

6 . . . . . . 1 Proteína apenas MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
ORGANELAS Lisossomos Mitocôndria Golgi Núcleo SOBRENADANTE F 1 2 3 4 .1 .2 .3 .3.1 .3.2 2. 3.N Precipitação com Sal/Solvente Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) .3.N.X 1 Proteína apenas (0.001g) a 0.5% total Gel Filtração MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Além dos métodos de purificação, análises complementares devem ser feitas ao longo da purificação, para verificar se o processo de separação está sendo eficiente. A medida da atividade biológica da proteína de interesse e do conteúdo de proteínas de cada fração resultante do processo de separação devem ser feitas a cada passo. Assim, apenas a fração que contém a proteína de interesse, marcada com um círculo vermelho no fluxograma, é submetida à próxima etapa de purificação. Medida da atividade biológica - particular para cada proteína - deve ser quantitativa, para estimar quanto da proteína de interesse há em cada fração. Medidas do conteúdo proteico (diversos) - absorbância de luz UV de 280 nm - métodos colorimétricos (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)

7 Métodos para medida do conteúdo de proteína:
Comprimento de onda Absortividade molar, e O gráfico mostra o espectro de absorção de luz UV dos aminoácidos aromáticos Trp, Tyr ou Phe. A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos na sua composição, especialmente triptofano. A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.

8 Métodos para medida do conteúdo de proteína:
Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 1. Cu2+ é quelado pela proteína [Cu2+-proteina] 2. Reação redox Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína] Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250 Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas. Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina. Método de Lowry Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul. BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul,

9 (para romper tecidos e células)
Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). tecidos células Homogeneização (para romper tecidos e células) por pressão (prensa francesa) liquefação (Potter) Homogenado ou Extrato bruto Material de partida Material na fonte por ultra-som com detergente Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.

10 Detergentes podem ser iônicos e não iônicos
Proteínas integrais da membrana detergente micelas Complexos não micelares Dependendo da concentração Sendo a proteína de interesse uma proteína de membrana, é necessário solubilizá-la. Para esse fim são utilizados detergentes, que dissolvem a membrana plasmática e formam complexos solúveis com as proteínas. Detergentes podem ser iônicos e não iônicos Detergentes não iônicos Triton X-100 (polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol) SDS Dodecil sulfato de sódio Cetab Cetyltrimethylammonium bromide Deoxicolato de sódio Detergentes iônicos Octilglicosídeo (octyl-b-D-glucopyranoside)

11 A centrífuga centrifugação diferencial
Câmara blindada Amostra sedimentando refrigeração vácuo rotor ângulo fixo A centrifugação frequentemente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. Através de sucessivas etapas de centrifugação com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se obter diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos. centrifugação diferencial homogenado células intactas pedaços de membrana núcleos mitocôndrias lisossomos ribossomos fração citoplasmática sangue centrifugado: separação de plasma e células

12 Força centrífuga Centrífuga Clínica Ultracentrífuga R$ 3.000
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar. Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g) Centrífuga Clínica Ultracentrífuga (necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração) 1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas 200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos R$ 3.000 US$ 70,000 Preço aproximado

13 Centrifugação em gradiente de densidade
A centrifugação em um meio com gradiente de densidade melhora a eficiência da separação. As partículas se deslocarão através do gradiente até encontrarem uma região com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando “bandas”. Gradientes podem ser utilizados para separar diferentes tipos de células, organelas, ácidos nucléicos, complexos proteicos, etc. Centrifugação em gradiente de densidade Solucões de sacarose com densidades diferentes são colocadas no tubo, uma sobre a outra Amostra é colocada no topo do gradiente 5% sacarose 20% sacarose centrifugação Baixa densidade Média densidade Alta densidade Gradiente separação de: Ficoll-Hypaque leucócitos Sacarose mitocôndrias Cloreto de césio ácidos nucléicos

14 A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas. Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas. A precipitação de proteínas pode ser induzida por: - adição de sais (Precipitação salina) - adição de solventes - variação de pH (Precipitação isoelétrica) O gráfico ao lado ilustra o efeito de diferentes sais sobre a solubilidade da hemoglobina. Em baixa concentração salina, a solubilidade das proteínas aumenta, pois os íons do sal ajudam a reforçar a camada de solvatação. Em alta concentração salina, a solubilidade das proteínas diminue pois os íons do sal competem pelas moléculas de água disponíveis para formar a sua própria camada de solvatação. Sais com ânions divalentes são mais eficientes do que os monovalentes na precipitação de proteínas. Solubilidade da hemoglobina (S/S’) KCl NaCl MgSO4 (NH4)2SO4 K2SO4 Concentração do Sal,, Molar Salting-in X Salting-out

15 - precipitam primeiro: proteínas maiores proteínas mais hidrofóbicas
Sais se dissociam em solução aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação. Solubilidade, log Fibrinogênio Pseudoglobulina Mioglobina Albumina Hemoglobina Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar Considere uma solução com fibrinogênio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observe o gráfico. Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4, pode-se purificar completamente o fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois este precipita totalmente em uma saturação de 2,8 M do sal. Neste ponto, centrifuga-se a solução e o fibrinogênio é coletado como um precipitado. Numa próxima etapa, adicionando-se mais sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina. E teremos também purificada a mioglobina, ainda em solúvel na presença de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante. Proteínas apresentam diferente sensibilidade para a precipitação salina. - precipitam primeiro: proteínas maiores proteínas mais hidrofóbicas possuem camadas de solvatação maiores ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar.

16 Os mais utilizados são etanol e acetona.
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam a camada de solvatação menos organizada. Água Dimetilformamida Metanol Etanol Acetona Clorofórmio Benzeno 78.5 1.85 48.9 3.96 32.6 1.66 20.7 2.72 2.3 0.00 Solvente Constante Dielétrica Momento Dipolar Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. Os mais utilizados são etanol e acetona. Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

17 Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação. Aos precipitados obtidos com sal ou solvente, adiciona-se água. Ao precipitado obtido com variação de pH, retornar ao pH original. Membrana de celofane solvente solução a ser dialisada início final Dt Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise. amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d. - o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja - excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente - após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.

18 Até o momento, exploramos as etapas iniciais de purificação de proteínas, como a centrifugação diferencial e precipitação fracionada. Esses métodos, apesar de terem baixo poder de resolução (exploram diferenças grosseiras entre as proteínas), permitem processar grandes volumes ou massas, típicos das etapas iniciais de isolamento. Quando já houve redução significa-tiva dos montantes de proteínas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que irão explorar as diferenças mais sutis entre as moléculas. Não esquecer que todas as frações obtidas devem ter o conteúdo de proteínas e de atividade biológica medidos, para se decidir qual/quais deverão passar para o passo seguinte da purificação. ORGANELAS Lisossomos Mitocôndria Golgi Núcleo SOBRENADANTE F 1 2 3 4 .1 .2 .3 .3.1 .3.2 2. 3.N Precipitação com Sal/Solvente Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) .3.N.X 1 Proteína apenas (0.001g) a 0.5% total Gel Filtração MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)

19 Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia: Amostra com diferentes componentes Resina embebida em tampão Tempo zero Concentração Tempo ou volume Coletor de frações Tempo 1 Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão Tempo 2 Tempo n Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como: massa molecular carga elétrica solubilidade afinidade Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.

20 Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ? Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: separação de moléculas pela massa molecular géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros Cromatografia de troca iônica: separação de moléculas pela carga elétrica géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica): separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso géis possuem carácter hidrofóbico Cromatografia de afinidade: separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

21 Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular
Moléculas com massas diferentes grão da resina poroso proteína grande proteína pequena Tampão “empurra” moléculas através da resina tubos Fluxo do tampão grãos (beads) da resina com poros Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).

22 traçado da medida de atividade biológica nas frações
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo. Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular. Curva de calibração Observar a escala log traçado da medida de atividade biológica nas frações Moléculas maiores Moléculas menores Massa molecular (kD) Absorbância a 280 nm Ler a massa correspondente Medida da ativ. biológica mL mL volume de eluição Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao. volume Kav

23 Resinas para Gel-Filtração
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas indica quais os tamanhos das partículas que podem entrar nos poros da resina e serem fracionados. Acima ou abaixo da faixa, não há separação. Resinas para Gel-Filtração Sephadex G - 10 Dextrana 0.05 0.70 25 1 5 50 30 100 4 150 200 600 Bio Gel P 2 Policrilamida 0.1 1.8 6 1.5 20 2.4 40 300 60 400 Sepharose 6B Agarose 4.000 Sepharose 4B 20.000 Sepharose 2B 70 40.000 NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO (kD) *Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio Gel: Bio Rad Laboratories Moléculas pequenas Proteínas Moléculas pequenas Proteínas Células, partículas sub-celulares

24 Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de gel-filtração.
O gel nessa coluna é o Sephadex G-200, cuja faixa de resolução de proteínas é de a d. Observe como proteínas nos extremos da faixa de resolução tendem a “sair” da parte linear da curva. Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. Kav = Ve-Vo Vt-Vo Ve – volume de eluição de uma certa proteína Vt – volume total da coluna Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com massa acima da resolução da resina onde:

25 Cromatografia de troca iônica
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH. Trocadora de ânions Trocadora de cátions DEAE CM Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

26 Cromatografia de troca iônica
- O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.

27 Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
Adsorção No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): + A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; eluição das proteínas adsorvidas. Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna Eluição Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna. + Na+Cl- + Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.

28 Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica. Proteínas apresentam carga positiva quando em meio ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em meio alcalino em relação ao seu pI. Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio. Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 -COOH COO -NH3 H + - -NH2 PI ácido + básico - neutro A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos aminoácidos ácidos e básicos. Responda: em pH 7,0, qual será a carga elétrica da albumina, da mioglobina e do citocromo C ?

29 DEAE CM Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica Eluição NaCl
Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição. As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina). _ = + (+) 0. 10 M 0. 15 M 0. 20 M Eluição NaCl Não retidas DEAE + 0. 10 M 0. 15 M 0. 20 M Eluição NaCl (-) _ = Não retidas CM Carboximetil~celulose (trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose (trocadora de ânions)

30 Tipos de Resina de troca Iônica
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH 2 N+(CH 3 ) Troca aniônica resina de polistireno Dowex 50 SO -H Troca Catiônica DEAE celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas N+(C H 5 ácidas e neutras CM Ácida Carboximetil COOH básicas e neutras Sephadex Gel de dextrano Combinação de gel filtração básico e troca iônica de proteínas ácido * Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio Gel: Bio Rad Laboratories Tipos de Resina de troca Iônica Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

31 Cromatografia de afinidade:
Ex: cromatografia de imunoafinidade Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). Desprezar proteínas não retidas Lavagem Eluição pH 2,0 ou sal Antígeno A puro Anti-A interage apenas com a proteína A - Mistura de proteínas Coluna empacotada com esse gel Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-A Adsorção Complexo Ag-AC é desfeito Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre

32 Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo - análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores - haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com “tag” ou “marcação” - glutationa-S-transferase - poli-Histidina 2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: 8-AEA-cAMP 8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate (ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP) Ligante grupo-específico Especificidade Proteína A Região Fc de IgG Proteína G Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil- Cibacron Blue Várias enzimas, albumina lisina Plasminogênio, RNA ribossomal arginina proteinases tipo tripsina benzamidina calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina heparina Fatores de coagulação, lipases, hormônios, receptores estoróides, etc Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos de His expostos Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade

33 Preparo da resina de afinidade:
Passo 1. Ativação da resina Passo 2. Acoplar o ligante Estratégias para acoplamento de ligantes à resina Reagente Alvo no ligante Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina. A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco. Braço espaçador covalente entre a resina e o ligante Ligação reversível não covalente ligante Molécula-alvo (analito)

34 Cromatografia de Partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar. Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc. Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico. Fase estacionária (suporte sólido) X Fase móvel (líquido ou gás) Consiste de 2 sistemas: AMOSTRAS - Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel Duas Possibilidades - Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária Dois tipos de montagem: Suporte: PAPEL Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose) Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico) CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO Suporte: GEL DE SÍLICA (camada delgada ou TLC) CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA Fase Estacionária: sílica (mineral apolar) Fase Móvel: Solvente aquoso ou água

35 Cromatografia de Partição
tempo t t tn Papel ou placa de sílica direção do fluxo do solvente distância de migração da substância distância de migração do solvente R f = Amostra na origem Compostos separados Cuba com solvente (fluxo por capilaridade) Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um valor de Rf característico. Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação) diferentes compostos. Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o composto isolado.

36 HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias. Característica diferencial da cromatografia convencional: partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) aumento da eficiência da separação em função do número maior de grãos de resina em um mesmo volume da coluna fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna Desenho básico de um HPLC bombas Injetor de amostra Coluna e forno Coletor de frações Detector Controle e análise dos dados Duas bombas permitem eluição em gradiente Detector: índice de refração, absorbância UV ou Vis, fluorescência, etc. Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluição diferencial na fase reversa

37 Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C
Absorbância a 214 nm Tempo ou volume de retenção % de acetonitrila 100 Moléculas não retidas Moléculas retidas Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila Fase estacionária Função C18 –Si (CH3)2 C18 H37 C8 –Si (CH3)2 C8 H17 tC2 –Si C2 H5 Aminopropyl –Si (CH2)3 NH2 Cyanopropyl –Si (CH3)2 (CH2)3CN Diol –Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas) Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água - acetonitrila, metanol, propanol CN Fenil NH2 C4 C8 C18 Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia

38 camada de H2O solvatação
Cromatografia de interação hidrofóbica É um processo de partição que explora a interação entre aminoácidos apolares de uma proteína e uma matriz de carácter hidrofóbico. Proteínas em solução salina concentrada “perdem” parte da camada de solvatação para os sais, expondo na superfície regiões ricas em aminoácidos apolares, que interagem com uma matriz hidrofóbica P Proteína altamente hidrofílica Proteína menos hidrofílica camada de H2O solvatação H matriz hidrofóbica Três estratégias para eluição: 1. diminuir a concentração de sal 2. diminuir a polaridade da fase móvel 3. adicionar detergente volume [Proteína] [sal] Força da interação hidrofóbica aumenta com o tamanho da cadeia de C na resina: Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8) Eficiência dos sais em provocar “salting-out” varia com a série de Hofmeister: Ânions: PO4-2> SO4-3>CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN- Cátions:NH4+>Rb+>K+>Na+>Cs+>Li+>Mg+>Ca+>Ba+

39 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína: Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação. Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura). Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas que apresentam pouca atividade). Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse.

40 EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.
Purificação da Glicoquinase hepática de Rato Etapa Atividade Específica b ( U ( U.mg-1) . - a Rendimento c ( % ) 0.17 2.0 85 12 23 45 140 Marcha A: somente cromatografias convencionais 1. Sobrenadante de pâncreas 2. (NH4) 2 SO4, precipitado 25 -55% 3. troca iônica, coluna DEAE -Sephadex , pH 7.0, eluição KCl 4. troca iônica, coluna CM cellulose , pH 5.5, NaCl 6. interação hidrofóbica, coluna Butyl~Sepharose 7. gel filtração, coluna Sephacryl S -300 130 Marcha B: com cromatografia de afinidade 0.09 2. troca iônica, coluna DEAE Sephadex 3. Afinidade cromatográfica ( benzamidina~agarose ) Índice Purificação a U nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza a transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas b Atividade específica : medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína c Rendimento : percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação d Índice de Purificação : razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa. Uma tabela como a vista acima é a maneira usual de se descrever o resultado de uma purificação. No exemplo acima, a mesma proteína foi isolada por duas “marchas” diferentes de purificação (A e B). Observe os parâmetros de purificação. Se você fosse repetir essa purificação, qual esquema de purificação escolheria ? EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.

41 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas. Fornece informações sobre a massa molecular e composição de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor. A poliacrilamida é um polímero que um gel de malha porosa. A poliacrilamida funciona como uma peneira, deixando passar através de seus poros as moléculas pequenas e retendo as grandes poliacrilamida Catalisador (persulfato de amônio) + acrilamida N,N´-metilenobisacrilamida É formado a partir da reação de acrilamida e bisacrilamida. concentração de acrilamida variando de a 20% determina o diâmetro dos poros uso de gradiente de acrilamida aumenta o poder de resolução o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na presença do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)

42 Desnaturação de proteínas por SDS
H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- Sódio dodecil sulfato A porção hidrocarboneto do detergente interage com as regiões hidrofóbicas da proteína, dispondo o grupo sulfato carregado na superfície, em contacto com o meio aquoso. A repulsão entre os grupos fosfato desestabiliza os laços não covalentes que mantém a estrutura 3D da proteína, desnaturando-a. Efeito do SDS desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através dos poros da poliacrilamida; mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas migrem para o anôdo; facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias

43 cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE) O desenho ao lado mostra o tipo mais comum de cuba para PAGE. Na cuba, o gel é polimerizado entre duas placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm uma da outra. Antes da polimerização, um pente é colocado na parte superior do gel para formar os poços onde serão colocados de 5 a 20 microlitros de cada amostra, misturadas com azul de bromofenol, um indicador da corrida. As partes superior e inferior do gel fazem contacto com recipientes de tampão, onde estão os eletrodos que estabelecerão o campo elétrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h). Terminada a corrida, as placas são retiradas da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente retirado e corado para revelar as bandas de proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie Blue ou nitrato de prata. amostra Poços para as amostras catodo 1 mm tampão Placas de vidro gel anodo tampão cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

44 Eletroforese em Meio Redutor
SDS-PAGE das proteínas da bactéria Salmonella tiphymurium Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a determinação do número de cadeias e tipo de ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas Direção da migração Padrões AB A B Sem Com 2 - Mercaptoetanol 2 - Mercaptoetanol B s SH A Cada linha (banda) corada no gel representa uma proteína

45 SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas
A migração eletroforética, expressa como mobilidade relativa, é proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se proteínas padrões com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibração do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de uma proteína desconhecida na curva, pode-se estimar a sua massa molecular. Mobilidade relativa Massa molecular (kD) Mr 97.4 87.0 45.0 29.0 21.0 12.5 6.5 (-) (+) Mobilidade relativa = distância percorrida pela banda X distância percorrida pelo marcador da corrida Curva de calibração de SDS-PAGE Proteínas padrões em um SDS-PAGE

46 Terminamos aqui a 4ª.aula online do curso de Biofísica de Proteínas.
Os assuntos abordados nessa aula são: Métodos de centrifugação e precipitação diferencial Dosagem de proteínas Métodos cromatográficos Análise de eficiência da purificação Na aula prática, vocês terão oportunidade de ver alguns tipos de cromatografia funcionando.