Calorimetria em estudos biofísicos Karin A. Riske

Apresentação em tema: "Calorimetria em estudos biofísicos Karin A. Riske"— Transcrição da apresentação:

1 Calorimetria em estudos biofísicos Karin A. Riske kariske@unifesp.br

2 1ª lei  E univ = 0 2ª lei  S univ ≥ 0  E sis +  E viz = 0  S sis +  S viz ≥ 0  E sis +  E viz = condições de interesse biológico T, P constantes  V sis = –  V viz (q P sis – P  V sis ) + (q P viz – P  V viz ) = 0 q P viz = – q P sis = –  H sis  S sis +  S viz ≥ 0  H sis - T  S sis ≤ 0 G ≡ H - TS  G =  H - T  S  G sis ≤ 0 energia livre de Gibbs (q sis - w sis ) conceitos termodinâmicos

3  G =  H – T  S  G < 0processo espontâneo  G > 0processo não espontâneo  G = 0equilíbrio termodinâmico energia útil para realizar trabalho calor absorvido (endo ) > 0 liberado (exo) < 0 contribuição entrópica balanço entre  H e T  S T, P constantes conceitos termodinâmicos

4  G =  H – T  S < 0  H < 0  S > 0 sempre espontâneo  H > 0  S < 0 nunca espontâneo  H < 0  S < 0 T baixa  H > 0  S > 0 T alta

5  H - entalpia rearranjo das ligações/interações químicas quebra de ligações: processo endotérmico (  H > 0) formação de ligações: processo exotérmico (  H < 0) Tipo de interaçãoEnergia de interação (kJ/mol) ligação covalente200-800 iônica40-400 ligação de hidrogênio20-40 íon-dipolo4-30 dipolar0,4-4 van der Waals4-30* * apenas significativa a distâncias muito pequenas entre átomos/moléculas, diminuindo abruptamente com a distância.

6  S - entropia S = k lnW entropia de um sistema está ligada ao número de arranjos microscópicos (microestados) de um sistema macroscópico peptídeolipídio

7 exemplo 1: gelo → água  H > 0  S > 0  G > 0 para T < 0 o C  G = 0 para T = 0 o C  G 0 o C processo espontâneo?  H ?  S ?  G =  H – T  S ≤ 0

8  H – interações  S – graus de liberdade interações feitas E-S interações desfeitas E-água S-água conformações E-S, água conformações E-água, S-água, água  G =  H – T  S ≤ 0 exemplo 2: enzima E + substrato S → complexo ES

9 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) Mede o calor específico de uma substância em função da temperatura: transições de fase Mede o calor liberado/absorvido decorrente da interação entre dois compostos (T constante)

10 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) sólido líquido água gelo ordem desordem fase gel fase fluida  H > 0 absorção de calor estado nativoestado desnaturado estudo de transições de fase bicamadas lipídicas desnaturação de proteneínas

11 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)

12 Amostra Referência  T = 0 T (K/s)  P (J/s) cela adiabática  Cp (J/K) velocidade de varredura

13 Hidrofílica: polar Hidrofóbica: apolar Bicamadas lipídicas lipídios e detergentes: moléculas anfifílicas auto-agregação devido ao efeito hidrofóbico (ganho entrópico de moléculas de água “bulk”) cmc (concentração micelar crítica) detergentes

14 Bicamadas lipídicas Lipossomo Vesícula Bicamadas lipídicas lipídios

15 gel fluid TmTm transição de fase de bicamadas

16 DMPC  S =  H / T m  G = 0 (T m )  H é a energia necessária para quebrar as ligações/interações existentes na fase ordenada

17 PC 18:0 16:0 14:0 transição de fase de bicamadas - comprimento da cadeia

18 cadeiaT m ( o C) 12:0 14:023 16:041 18:055 20:066 22:075 4-20 di18:0 18:0 / 18:1 di18:1 - comprimento da cadeia - grau de insaturação (duplas ligações) transição de fase de bicamadas

19 colesterol alargamento da transição - efeito do colesterol

20 DMPG transição de fase de bicamadas lipídio aniônico

21 [NaCl] transição de fase de bicamadas comportamento “normal” comportamento “peculiar”

22 Proteínas Estrutura de proteínas: primária: sequência de aa secundária: ligações H formando padrões repetidos terciária: arranjo 3D quaternária: arranjo 3D de mais de uma cadeia  -folha  -hélice

23 Desnaturação de proteínas estrutura funcional perda da função TmTm

24 Desnaturação de proteínas

25 Nativa Maior transição Intermediário Desnaturada Desnaturação de proteínas

26 CpCp TmTm HH 2030405060708090 Temperatura (°C) C p (kJ/mol/°C)  C p : reflete mudanças no estado de hidratação da proteína quando resíduos hidrofóbicos são expostos ao solvente

27 T m shift of chymotrypsinogen (1.8 mg/ml) with increasing pH. Desnaturação de proteínas pH aumento da estabilidade da proteína

28 DSC scans of Ribonuclease A with increasing concentrations of the inhibitor 2’CMP. Desnaturação de proteínas [inibidor] aumento da estabilidade da proteína

29 calorimetria de titulação isotérmica (ITC) estudo da afinidade/ligação entre substâncias composto A composto B cela de medidacela de referência

30 MedidaReferência  T = 0 dP (  cal/s) cela adiabática ITC reference power: 0-30  cal/s Temp constante

31 ITC

32  H - medido  S = (  H –  G)/T K - modelo  G = – RTlnK

33 ITC exemplo 1: determinação da CMC de detergentes e  H mic CMC  H > 0  S > 0 efeito hidrofóbico clássico

34 ITC  H demic = - 1.8 kcal/mol CMC = 0.27 mM Triton X-100 tampão

35 ITC exemplo 2: partição de detergentes em bicamadas, K, e  H W-bilayer [Triton X-100] < cmc lipossomos

36 ITC insertion C f det exemplo 2: partição de detergentes em bicamadas, K, e  H W-bilayer C lip C b det K – constante de afinidade

37 ITC exemplo 2: partição de detergentes em bicamadas, K, e  H W-bilayer

38 ITC exemplo 3: interação peptídeo antimicrobiano-lipídio

39 ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio P + L PL K app = [PL] / [P][L]  G o = - RT ln K app K int = [PL] / [P] surf [L] [P] surf = [P]  e -e  o/kT  o – potencial de superfície muda à medida que o peptídeo se liga modelo de Gouy-Chapman + _ _____ ____

40 ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio lipossomos + peptídeos

41 b) ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio Gomesina Acanthoscurria gomesiana _ _____ ____ 1:1 POPC:POPG z = +6 anfipático

42 ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio ajuste com o modelo: K = 10 4 M -1  H = -7.8 kcal/mol peptídeo z p ~ 6 ~6 POPGs / Gm / +-  G = RT lnK ~  H (  S ~0) processo exotérmico

43 ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio Análogos da gomesina (aa específicos silenciados para alterar o balanço hidrofílico-hidrofóbico) + hidrofóbicos interação mais forte + hidrofílicos interação mais fraca

44 Agradececimentos Tatiane Sudbrack Bruno Mattei Tatiana Domingues Katia R. Perez Antonio Miranda M. Teresa Lamy