S TEM C ELL D IVISION IS R EGULATED BY THE M ICRO R NA P ATHWAY MATHEUS ANDRADE RAJÃO S. D. Hatfield, H. R. Shcherbata, K. A. Fischer, K. Nakahara, R.

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1 S TEM C ELL D IVISION IS R EGULATED BY THE M ICRO R NA P ATHWAY MATHEUS ANDRADE RAJÃO S. D. Hatfield, H. R. Shcherbata, K. A. Fischer, K. Nakahara, R. W. Carthew and H. Ruohola-Baker NATURE 2005

2 Introducão Dicer Silenciamento MicroRNAs e siRNA

3 Introducão - Repressão gênica via microRNA: -Havia registros anteriores de miRNA diferencialmente expressos em células tronco -Sugeriu-se então que miRNAs poderiam ter um papel na regulação do caráter tronco

4 Experimento Como testar ??? Inibir a via de miRNA Drosophila melanogaster dicer 1 dicer 2 Processamento de miRNA Processamento de siRNA Proposta: eliminar dicer 1 Elimina miRNA Pouco efeito em siRNA

5 Experimento Células tronco da linhagem germinativa (GSC) -Se renovam -Divisões geram câmaras de células -Que se diferenciam em blastocistos Ovário de Drosophila

6 Experimento 1 - Analisar se a ausência de dcr 1 altera a taxa de divisões celulares Wild Type dcr 1 -

7 Experimento 1 - Vários estágios do desenvolvimento estão faltando nos mutantes em dcr 1 Wild type dcr 1 -

8 Inferências obtidas com o experimento 1 -Dcr 1 mutante X heterozigoto Pouco desenvolvimento das câmaras Dicer 1 requerida para produção de linhagem germinativa - Dcr 2 mutante X heterozigoto (data not shown) Desenvolvimento normal das câmaras Indica a participação de somente miRNA, e não siRNA

9 Experimento 2 A GSC está boa? Está ruim? Manutenção Identidade Divisão

10 Experimento 2 Confirmar a identidade de GSC, e se ela está no lugar certo Marcadores de localização e de padrões de expressão

11 Experimento 2 Presença de espectrassomo confirmada dcr 1 - (sem GFP)

12 Experimento 2 Marcadores de localização e de padrões de expressão Mad fosforilada: Indica que a sinalização por TGF- beta está funcionando

13 Experimento 2 dcr 1 - (sem GFP) dcr 1 - Presença de P-Mad confirmada

14 Experimento 2 Marcadores de localização e de padrões de expressão A ausência de BamC, causada pela sinalização de TGF-beta

15 Experimento 2 dcr 1 - (sem GFP) Segundo os autores, a ausência de BamC foi confirmada

16 Experimento 3 A GSC está boa? Está ruim? Manutenção Identidade Divisão

17 Experimento 3 Análise da distribuição dos estágios do ciclo celular nas GSCs mutantes Corando o ovário com anticorpos específicos para diferentes marcadores celulares

18 Experimento 3 Os mutantes em dcr-1 apresentaram um acúmulo de CycE Porém apresentam os outros marcadores em concentrações iguais ou reduzidas

19 Experimento 3 dcr 1 - (sem GFP) Isso sugere que os mutantes estão parando a divisão na transição entre G1 e S

20 Experimento 3 E em machos? Será que a ausência de dicer 1 provoca conseqüências similares? Cada testículo contém aproximadamente 10 GSCs circundando uma estrutura chamada “hub”

21 Experimento 3 Hub Esses dados mostram que em machos a dicer funciona semelhantemente, sugerindo que ela possui um papel conservado, na evolução, na divisão de GSCs

22 Experimento 4 Será que a via de miRNA regula o ciclo celular de outros tipos celulares? Em outros tipos celulares não se observou o acúmulo de CycE. (data not shown) Dessa forma, a via de miRNA se mostra específica para células tronco

23 Experimento 5 Será que a parada em G1/S estaria ligada à Dacapo (homólogo de p21/p27, inibidores de CDKs)? Dacapo sequestra CycE/CDK2 em um complexo estável e inativo, travando o ciclo em G1/S, com uma expressão prolongada de CycE Mutantes apresentaram mais GSCs coradas para Dacapo

24 Experimento 5 E se diminuirmos a expressão de Dacapo? O que acontece? Os níveis de CycE voltaram aos níveis normais

25 Experimento 5 - Ao que tudo indica, miRNA atua na célula tronco diminuindo os níveis de Dap - Como isso é feito?

26 Conclusões - Propôs-se então um mecanismo da via de miRNA que regula a divisão em células tronco