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Como a Bioquímica auxilia na descoberta de novas terapias Palestrantes: Gabrielle do Amaral e Silva Muller: Como a proteômica pode auxiliar a identificar.

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1 Como a Bioquímica auxilia na descoberta de novas terapias Palestrantes: Gabrielle do Amaral e Silva Muller: Como a proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos terapêuticos Priscila Graziela Alves Martins: Inibição enzimática como novo alvo para o tratamento de doenças como tuberculose, diabetes e peste Tiago Bortolotto: Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) podem ser usados em terapias? Universidade Federal de Santa Catarina Departamento em Bioquímica Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Projeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação Centro de Biologia Molecular Estrutural

2 Como a proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos terapêuticos Universidade Federal de Santa Catarina Departamento em Bioquímica Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Projeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação Gabrielle do Amaral e Silva Muller Florianópolis, 02 de junho de 2011 Centro de Biologia Molecular Estrutural

3 A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA. Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo. Técnica que visa caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares. DNA Pré- RNAm RNAm Proteoma

4 Por que utilizar a proteômica Na busca de novos alvos terapêuticos vem sido utilizada a proteômica, pois ela revela proteínas biomarcadoras permitindo a identificação de indivíduos doentes X indivíduos saudáveis. Genes alvos: presente em células sadias e patogênicas. Alterações na transcrição: RNA muitas vezes é expresso, porém não é traduzido. Proteínas: refletem diretamente se o individuo está com determinada doença por meio da interação ptn-anticorpo – ELISA. Moléculas biomarcadoras são utilizadas como uma importante ferramenta para detecção e monitoramento e tratamento de doenças. O status patológico de um indivíduo pode ser verificado por :

5 Em 2004, haviam 1619 artigos somente com pesquisas na área da proteômica (hoje ); Destes 192 artigos eram referente a proteômica clínica (hoje ); E, 71 eram referentes a procura de moléculas biomarcadoras utilizando-se a proteômica como ferramenta (hoje ); Proteômica

6 Diagnóstico: Próstata, mama, pâncreas, fígado, câncer de cabeça e nuca; Proteínas sinalizadoras são pouco abundantes em estágios iniciais; Falso negativo: indivíduos com câncer o exame negativo; Falso positivo: indivíduos sem câncer e exame positivo; Câncer Proteína CA – 125 (Câncer ovariano): são positivos 50 % a 60%. É elevado endometriose e gravidez;

7 2006: Clinical Proteomic Technologies for Cancer (CPTC) foi fundada para acelerar o desenvolvimento de tecnologias mais sofisticadas na busca de biomarcadores. National Cancer Institute

8 Proteômica

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12 Técnica relativamente barata; Rápida; Poderosa ferramenta na busca por biomarcadores em fuidos e tecidos humanos; Géis 2DE com espectrometria de massa e a utilização de sofisticadas ferramentas de bioinfomática são capazes de discriminar estados iniciais da doenças, de tumores belignos e malignos. Vantagens proteômica

13 Grande quantidade de proteína; Não detecta proteínas pouco abundantes; Durante a detecção pode ir outros tecidos e isso pode resultar na diminuição da precisão do método; Antes de iniciar a busca por biomarcadores é necessário a padronização e reprodutibilidade dos géis; Comprovação em diversos laboratórios; Desvantagens proteômica

14 Proteômica Proteômica sistemática: mapa protéico de: Tecidos Células Compartimentos celulares Proteômica sistemática: mapa protéico de: Tecidos Células Compartimentos celulares Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência: Desenvolvimento Interações entre microorganismos e hospedeiros Tratamentos Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência: Desenvolvimento Interações entre microorganismos e hospedeiros Tratamentos

15 Fluxograma das etapas experimentais

16 Tampão de liseLise mecânica da célula 30´ a 1200 x gGelo por 20 min Diversas macromoléculas Proteínas Extração da amostra 1.Não existe um método Universal; 2.Objetivo a serem visualizados no gel 2DE: Maior quantidade de proteína possível ou somente um subgrupo de proteínas; Solubilização das ptns Métodos de ruptura celular

17 Proteínas oriundas da extração Bradford 545 nm Métodos de quantificações de proteínas Com base na concentração da curva padrão da BSA. 2D Quant Kit 480 nm Com base na concentração da curva padrão da BSA.

18 Fosfolipídios e ácido nucléicos: listras horizontais; Sal provoca alta condutividade na fita de pH: pode provocar desidratação em algumas porções do gel e hidratação em outras. Ácidos nucléicos: causam aumento da viscosidade da amostra, aparecimento de bandas adicionais, obstrui poros e liga-se a proteínas. Polissacarídeos: bloqueiam poros do gel, aumenta o tempo de focalização; Lipídeos: ligam-se a proteínas e diminuem a mobilização das mesmas no gel. Limpeza das amostras

19 Agentes redutores: DTT Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia Agentes Surfactantes: CHAPS Solubilização das proteínas

20 Tiras de strip com pH imobilizado Re-Hidratação da amostra em gradiente de pH Tampões-acrilamida Temperatura ambiente 25 o C; Over night; GradienteFaixa de pH Linear4,0-7,0 6,0- 11,0 3,0- 10,0 Não linear3,0-10,0

21 Separação das proteínas em 1ª Dimensão É um método eletroforético que separa as proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos; Primeiro passo: escolha a faixa de pH ideal para a sua amostra; Temperatura; 3500V a qual é mantida por até mils volts/hora; Corrente elétrica

22 Strips foram removidos Cerâmica IEFStrips foram posicionados Paper Pads umedecidos Total: V/h e 25 uA/strip Ettan IPGphor 3Ajuste dos eletrodos Separação das proteínas em 1ª Dimensão

23 Após coloração com Coomassie Blue G-250 por 24h Separação 1ª dimensão Separação 2º dimensão Preparação do gel em placas: 1.Homogêneo; 2.Concentração da acrilamida é graduada. Eletroforese em 2º Dimensão É um método eletroforético que separa componentes de uma amostra de acordo com o peso molecular. Esta técnica é realizada em gel de poliacrilamida contendo SDS. 12,5%

24 Análise simultânea de diversas proteínas Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes. Análise das imagens dos géis

25 Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais) Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa Presença ou Ausência de spots Análise das imagens no gel

26 Descoloração Desidratação tripsinização Extração dos peptídeos Digestão in-gel Excisão dos spots Série de passos

27 Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos. Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas. Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós- traducionais das proteínas. Amostras 2- DE Fonte de ionização Analisador de massa Detector Sistema à vácuo Identificação das proteínas por espectrometria de massa

28 28 Identificação das proteínas por espectrometria de massa

29 Obrigada!!


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