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Aplicações da Eletroforese Capilar Ana Carolina Peiter Larissa Brussa Reis Micaela Domingues Rômulo Silva de Oliveira Stefani Natali Stoll Universidade.

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1 Aplicações da Eletroforese Capilar Ana Carolina Peiter Larissa Brussa Reis Micaela Domingues Rômulo Silva de Oliveira Stefani Natali Stoll Universidade Federal de Pelotas Disciplina de Genômica II Docente: Fabiana Seixas Pelotas, 02 de maio de 2012.

2 Transporte em solução eletrolítica Influência de um campo elétrico. Diferenças de mobilidades O que é Eletroforese?

3 Histórico Eletroforese capilar -1981, por Jorgenson e Lukacs ~ à técnica tradicional. Tubo capilar, preenchido com um eletrólito.

4

5 Conduzida em TUBOS O que é EC? 15 a 100 µm /50 a 100 cm CAMPOS ELETRICOS ALTOS BAIXO TEMPO ALTA EFICIENCIA E RESOLUÇÃO CAMPOS ELETRICOS ALTOS BAIXO TEMPO ALTA EFICIENCIA E RESOLUÇÃO

6 Grupos silanóis (SiOH) - (SiO- + H+)- soluções tampão. Fluxo Eletroosmótico cátodoânodo

7 Principais vantagens Fatores Geométricos Pequena demanda de amostra Injeção e Detecção Alta eficiência Baixo tempo

8 Variações da EC

9 Eletroforese capilar de zona (CZE) Capilar e os reservatórios - cheios com um tampão. Corrente Elétrica + Poder Tamponante Variações da EC

10 Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) Variação da CZE Separa Moléculas neutras Variações da EC

11 Focalização isoelétrica capilar (CIEF) Separação -PI pI não ocorre migração sob a ação de um campo elétrico Anfólito carreador Anfólito carreador Variações da EC

12 Eletroforese capilar em gel Separação pelo tamanho Migração através da matriz do gel Variações da EC Ausência de Fluxo Eletroosmótico

13 Eletroforese capilar em gel Variações da EC

14 Colóides liofílicas-poliacrilamida; Colóides liofóbicos-agarose. Variações da EC Eletroforese capilar em gel Rede Polímérica

15 RAPIDEZ VERSATILIDADE BAIXO CUSTO POR ANÁLISE ALTO PODER DE SEPARAÇÃO Vantagens gerais da EC

16 Não é adequada para: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS VOLATEIS NÃO POLARES Limitações gerais da EC

17 Sequenciamento de DNA

18 Relembrando... Método Químico (EUA) Maxam & Gilbert Método enzimático (Reino Unido) Sanger &Coulson

19 Método de Sanger

20 Molécula NativaDesnaturação Cadeia simples = MOLDE!

21 Manual X Automático

22 Eletroforese Capilar (Sanger- Automatizado) 1)PCR tradicional 2)Purificação do produto 3)Nova PCR (placa) 4)Purificação da placa 5)Sequenciamento 6)Análise dos resultados

23 1) PCR PROGRAMA: 94 0 C por 5 min 94 0 C por 1 min 55 0 C por 1 min 72 0 C por 1 min 72 0 C por 5 min 4 0 C 35 ciclos COMPONENTES: DNA molde dNTPs DNA Polimerase Primer Magnésio Tampão Água

24 2) Purificação do produto de PCR 3 formasKit GFXEnzimasPEG de 50 ul 2 de 25 ul Volume final 50ul Purificar Eluir 25ul gel de agarose 5ul 2.1) COM KIT: GFX PCR DNA (GE Healthcare)

25 2) Purificação do produto de PCR 2.2) COM ENZIMAS Exonuclease I (EXO I) -GE Healthcare- E70073Z (2.500U) Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) - GE Healthcare - E70092X 5000U

26 Pós-purificação Condições para a reação de seqüenciamento:

27 PCR purif + Primers (R/F) Nova PCR (DNA + Primers+ MIX) 3) Nova PCR

28 2ul de pré-mix 1ul do primer 2ul de DNA VortexSpinTermociclador 3) Nova PCR Poços não utilizados: água Lacrar!

29 3) Nova PCR

30 Purificação da Placa- Protoloco Sequenciador

31 5) Sequenciamento MEGABACE Sequencing e não Genotyping; RINSE TIPS limpeza dos capilares FLUSH AND DRY 1X semana MATRIX FILL AND PRERUN: matriz INJECT SAMPLES AND RUN (lado da placa correto) Placa com o LPA/ 180 minutos Pós: Store Cappilars (25ºC)

32 Picos Linha de base Distância entre picos Qualidade: BAIXA 4) Análise dos resultados (Cromatograma)

33 Qualidade: MÉDIA 4) Análise dos resultados (Cromatograma) Picos Linha de base Distância entre picos

34 4) Análise dos resultados (Cromatograma) Qualidade: ALTA Picos Linha de base Distância entre picos

35 Genotipagem Processo pelo qual identificamos cada polimorfismo de interesse para um grande número de indivíduos

36

37 Tudo parte pelo o DNA a ser analisado... Análise dos fragmentos de DNA amplificados por PCR Sequenciamento de DNA Eletroforese Capilar

38 Em animais Melhoramento clássico (seleção de indivíduos pelo seu fenótipo) Escolhas de características como: carcaça, leite, sexagem, doenças....

39 Em Microorganismos Antes dos capilares, sequenciadores... (Tipagem por testes morfológicos e bioquímicos, sensibilidade a fagos, sensibilidade a bacteriocinas, perfis imunológicos e perfis de susceptibilidade a agentes antimicrobianos). genes para proteínas da superfície celular genes de resistência a antibióticos genes codificando para o rRNA 16S.

40 Em Plantas Melhoramento genético Características comerciais: produção de amido; açúcar; Resistência a pragas; Resistência adversidades climais;

41 Em Humanos: Paternidade; Doenças hereditárias; Criminalistica; Medicina individualizada; Oncologia;

42 Técnicas com Eletroforese Capilar

43 1. Análise de AFLP Criação de mapas genéticos para novas espécies Determinação de parentesco entre as cultivares Estabelecimento de grupos de ligação em cruzamentos Diversidade genética e molecular Estudos de filogenia Variações nos padrões das banda permitem os indivíduos ser genotipados ou diferenciados com base sobre os alelos que carregam. Extração de DNA Enzimas de Restrição PCR Preparação das amostras Eletroforese Capilar Análise dos dados

44 2. Análise ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) (ISSR) PCR é uma maneira rápida e barata com base na variação nas regiões entre os microssatélites. Este método tem uma grande variedade de usos, incluindo: Caracterização da relação genética entre populações, Impressão digital genética, Marcação de gene, Detecção de variação clonal, Identificação de cultivares, Análise filogenética, Detecção de instabilidade genômica, Avaliação de hibridização. Purificação do DNA Design de Primer PCR Preparação das amostras Eletroforese Capilar Análise dos dados

45 3. Os microssatélites STR Os locos de microssatélites conhecidos como STRs (short tandem repeats ou repetições curtas consecutivas) apresentam alelos ou fragmentos de DNA de 100 a 300 pb; Estudos de mapeamento de ligação; Estudos de associação e identificação de organismos.

46 3.1. Instabilidade microssatélite Descreve a fidelidade reduzida durante a replicação do DNA repetitivo frequentemente que ocorrem nas células tumorais.

47 4. SNP Genotyping São variantes de DNA comuns presentes em todo o genoma humano SNPS têm sido mostrados para ser responsável por : -diferenças nas características genéticas, - susceptibilidade a doenças e resposta a terapias de droga. Purificação do DNA Template Design de Primer PCR Limpeza da Amostra Reação de Sequenciame nto Limpeza da Reação Eletroforese Capilar Análise dos Dados

48 5. RFLP T-RFLP análise é uma técnica utilizada para estudar comunidades microbianas complexos baseados em variação no gene 16S rRNA. Tem sido usado para examinar as populações bacterianas em diversos ambientes naturais e compreender a estrutura da comunidade e dinâmica em resposta a alterações nos parâmetros ambientais ou fisiológico.

49 Aplicações Artigos Científicos, Teses e Dissertações

50

51 Utilização acoplada à espectrometria de massa: Poder de resolução e eficiência da CE Universalidade e sensibilidade da MS Solutos que apresentam pequenas variações no tempo de migração, ou até mesmo que migram com a mesma velocidade, podem ser identificados.

52 Nos últimos 20 anos... CE+MS notoriedade crescente como ferramenta analítica Anualmente, a Electrophoresis, dedica uma edição especial inteira a trabalhos exclusivos com CE-MS.

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54 Baixa disponibilidade de amostra Testes pediátricos, geriátricos e forenses Menos que 10 nL de amostra por injeção Métodos analíticos aplicados a análises clínicas

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56 Separar cafeína e outros derivados em amostras de saliva, soro e urina Alíquotas aplicadas diretamente sem qualquer pré- tratamento A resolução e a reprodutibilidade foram satisfatórias e somente 2 min foram consumidos para se efetuar a análise. Eletroforese capilar Sensibilidade, precisão e especificidade Tempo de análise 2x menor Cromatografia líquida de alta eficiência Método equivalente Consumo de solvente é 100 vezes maior Cromatografia capilar eletrocinética micelar

57 Conclusão Ferramenta valiosa na separação simultânea de metilxantinas e outros compostos com funções químicas diversas. Sensibilidade, precisão e exatidão satisfatórias.

58 Análise de resíduos de pesticidas em alimentos Análise de ácidos nucléicos, bem como seus adutos, por detectar níveis bem abaixo dos permitidos por lei. Adutos de benzopireno foram avaliados, uma vez que são compostos policíclicos aromáticos presentes no meio ambiente.

59 Metabólitos (hemoglobina glicada, cetoácidos, hormônios), Forense: investigação de drogas (canabinóides, anfetaminas) em fluidos alternativos Clínica Emissões veiculares (aldeídos e cetonas) e águas de abastecimento (pesticidas). Ambiental Pureza, qualidade de fármacos anti-retrovirais (AIDS) e anti-câncer (ftalocianinas metaladas). Fármacos Constituintes (carboidratos, ácidos graxos, ácidos carboxílicos,), aditivos (corantes e vitaminas) e contaminantes (pesticidas). Alimentos Extratos vegetais (compostos fenólicos), óleos essenciais e hidrolisados de proteína de interesse fitoterápico. Produtos naturais

60 Eletroforese Capilar como ferramenta analítica para a toxicologia forense

61 Fármacos e drogas de abuso de interesse forense Cloridrato de Metanfetamina designer drugs - Ectsasy Agente simpatomimétic o cloridrato de cocaína - crack Heroína - diacetilmorfina Morfina

62 Soluções de trabalho em diferentes concentrações Soluções Padrão Capilar de Sílica fundida 75um – 48,5cm 25kV Equipamento NaOH 1M por 5 min Eletrólito de corrida -20 min Condições 87 amostras humor vítreo Solventes orgânicos Preparo amostras Gráfico 3D: tempo de retenção, espectro de luz e intensidade de luz absorvida Detector por arranjo de diodos OBJETIVO Elaboração de sistemática analítica para determinação de drogas de abuso e seus produtos, empregando a técnica de Eletroforese Capilar.

63 Resultados e Conclusões A Eletroforese Capilar com detecção de diodos pode ser utilizada para detecção e quantificação de drogas de abuso em humor vítreo, pois fornece limites de detecção, quantificação, precisão e exatidão adequados para essa finalidade.

64 Determinação e quantificação das vitaminas C e E associadas em produtos cosméticos

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66 OBJETIVO Validação das metodologias analíticas para a determinação e quantificação do derivado do ácido ascórbico, tetraisopalmitato de ascorbila e o princípio ativo acetato de tocoferila que estão associados nas formulações cosméticas. Extratos em pó Placebo Amostras Espectrofotometria no UV Cromatografia Eletroforese capilar Análises Sílica – 50cm/50um NaOH 0,1M por 15 min Água deionizada e eletrólito de corrida Eletroforese capilar

67 Resultados e Conclusões O desenvolvimento de metodologia analítica para a Eletroforese Capilar não obteve bons resultados através da técnica utilizando a microemulsão óleo-aquosa.

68 Desenvolvimento de metodologia para especiação de cromo em amostras por eletroforese capilar de zona

69 OBJETIVO Propor um desenvolvimento de um sistema de Eletroforese Capilar de zona para a determinação e especiação de metais em amostras de águas Açude da Marcela Indústria de Curtume, Sergipe Amostras Caseiro: fonte de alta tensão, capilar, eletrodos de platina, detector de UV, software Sistema Eletroforético Sílica, revestido pr grupos silanóis Água destilada, HCl 1M – 5 min NaOH 0,1M – 15 min Solução eletrolítica Capilares

70 Resultados e Conclusões A eletroforese capilar de zona com detecção UV mostrou-se adequada para separação de complexos Cr(III)-EDTA com tempo de análise inferior a 5 minutos. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que Cr(III) foi totalmente complexado pela matéria orgânica dissolvida nas águas do curtume e do açude. Nenhum sinal referente aos picos do complexo foi observado nos eletroferogramas.

71 Referências /pt-br.php br.php rio.br/pergamum/tesesabertas/ _06_cap_02.pdf

72 Obrigado pela atenção!


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