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Imunologia Clínica Imunoensaios - Precipitação. Anticorpos Monoclonais: A utilização de anticorpos como ferramentas de identificação de estruturas tem.

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1 Imunologia Clínica Imunoensaios - Precipitação

2 Anticorpos Monoclonais: A utilização de anticorpos como ferramentas de identificação de estruturas tem sido cada vez mais freqüente, principalmente no diagnóstico clínico. O uso de misturas de anticorpos tem aplicação limitada – múltipla especificidade e heterogeneidade da resposta imune humoral. Soro policlonal: Muitos tipos diferentes de anticorpos produzidos por vários clones de linfócitos B, específicos para diferentes antígenos. Como resolver esse problema????

3 Anticorpos Monoclonais: Georges Koller e Cesar Milstein (1975): Descreveram a 1ª técnica para a obtenção de anticorpos homogêneos ou monoclonais de especificidade definida. Ganharam o Prêmio Nobel em Imunização com o antígeno Células do baço Clone de LB + Mieloma (Tumor de LB), não secretor de anticorpos Hibridoma: Podem ser mantidas in vitro indefinidamente e irão continuar secretar anticorpos com especificidade definida. Esses anticorpos são MONOCLONAIS.

4 IMUNOPRECIPITAÇÃO

5 As técnicas manuais de precipitação atualmente em uso são realizadas em meio gelificado, o que facilita a leitura e reduz os volumes necessários para a interação. No entanto requerem períodos de horas ou dias para a migração molecular e a formação do imunocomplexo. A técnica pode ser automatizada (turbidimetria e nefelometria). São técnicas muito mais sensíveis.

6 Técnicas baseadas na reação de precipitação: 1. Imunodifusão: Baseia-se na difusão de substâncias solúveis ao acaso em meio gelificado como o ágar ou gel de agarose. Enquanto as moléculas estão livres continua ocorrendo difusão, ao se formarem IC (alto PM), ficam imobilizados no gel, permitindo a visualização. A máxima precipitação ocorre na zona de equivalência. Podem ser classificadas em: Imunodifusão Simples: O Ac ou o Ag está fixado ao gel, enquanto o outro migra até a formação do IC. Imunodifusão Dupla: Ambos os reagentes estão livres para mover em direção ao outro e precipitar. O movimento pode ser linear ou radial.

7 1.a. Imunodifusão simples em uma dimensão (linear) Oudin (França). Difusão simples em tubo. Antígeno+ Gel Antígeno O tubo é selado e deixado à temperatura constante por aproximadamente 1 semana. AgAc Imunocomplexo

8 Princípio: Relação quantitativa entre a quantidade de Ag presente no poço e o anel de precipitação resultante. Tempo de incubação: 48 a 72 h Diâmetro do halo  [ ] Ag 1.b. Imunodifusão radial simples

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10 1.c. Imunodifusão dupla de Ouchterlony Nesta técnica os dois componentes, antígeno e anticorpo difundem-se radialmente em todas as direções, a partir de orifícios no meio gelificado, e se encontram formando linhas ou arcos de precipitação. Limitação: Requer 18 a 24 horas de difusão para que a reação se processe. Baixa sensibilidade.

11 Amostra 1: negativa; Amostra 2: positiva; Poços: Padrão 1.c. Imunodifusão dupla de Ouchterlony

12 Técnicas baseadas na reação de precipitação: 2. Imunoeletroforese: 2.a. Eletroforese: Técnica que permite a separação das proteínas de acordo com sua carga. O suporte de eletroforese é inerte e não influencia o fluxo das moléculas no campo elétrico. Suporte: papel, agarose ou acetato de celulose (corrida de eletroforese em tempo mais curto - 60 a 90 minutos). O soro ou outro material biológico é aplicado na origem e fracionado por cerca de 90 minutos, usando um tampão alcalino. A seguir as fitas são coradas para se detectar as proteínas e lidas em densitômetro, que converte o padrão em picos permitindo a quantificação.

13 2.a. Eletroforese:

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15 2.b. Imunoeletroforese: A técnica combina a eletroforese e difusão dupla em meio gelificado, em tempos distintos, com alto poder resolutivo Amostra (Ag) Eletroforese a b dc Soro a b dc Difusão AaAa Bb Dd Cc

16 Técnicas baseadas na reação de precipitação: 3. Eletroimunodifusão: 3.a. Eletroimunodifusão Simples Linear (Laurell ou Foguete) 3.b. Eletroimunodifusão Dupla Linear ou Contra- imunoeletroforese. Na eletroimunodifusão, a migração do antígeno e do anticorpo é dirigida por um campo elétrico, aumentando a velocidade de formação do imunocomplexo e a sensibilidade em relação à difusão natural.

17 Soro - Anticorpo Gel contendo o antígeno a. Eletroimunodifusão Simples Linear (Laurell ou Foguete)

18 Linha de precipitação 3.b. Eletroimunodifusão Dupla Linear ou Contra-imunoeletroforese.

19 Automação dos ensaios de precipitação

20 Nefelometria Uma das características das soluções coloidais é a pronunciada dispersão de luz. Quando um feixe de luz incidente atravessa um meio contendo partículas, essas interferem com a passagem da luz, fazendo com que seja dispersa em todas as direções. Mistura homogênea – Não há dispersão da luz. Mistura coloidal

21 Nefelometria Suspensão Ag-Ac Fonte de luz Lentes que captam os raios dispersos Lentes focalizadoras Detector Os raios de uma fonte de luz de alta intensidade (lâmpadas de halôgenio, laser) são dirigidos por lentes focalizadoras e passam através da amostra contendo os ICs. Os raios que emergem em ângulo de 70º são dirigidos por outra lente para o detector eletrônico. O sinal é matematicamente relacionado à concentração do Ag ou Ac.

22 Nefelometria A nefelometria é totalmente automatizada, de fácil realização, rápida e precisa. Ideal: Nefelômetros que subtraiam ruído de fundo (background), causados por amostras lipêmicas ou hemolisadas. Emprega pequenos volumes de amostra e tem alta sensibilidade. Pode ser aplicada nas determinações de proteínas de significado clínico em qualquer fluído corporal.


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