Introdução à Microbiologia Clínica

Apresentação em tema: "Introdução à Microbiologia Clínica"— Transcrição da apresentação:

1 Introdução à Microbiologia Clínica

2 Fases do Ciclo Diagnóstico:
Fase Pré-analítica (60% -70%) Coleta Transporte Fase analítica (20% - 30%) Fase pós-analítica (10%)

3 Coleta Realizada do local real da infecção;
Obtenção de uma quantidade suficiente de amostra Utilização de dispositivos apropriados para a coleta do material Obtenção de cultura antes da administração de antibióticos Identificação do material

4 Transporte Seringa: Frascos :
Exsudatos frescos ou amostras líquidas: procedimento válido para amostras enviadas para análise logo após a coleta. Frascos : Frascos de boca larga com sistema de fechamento eficiente contra vazamento e contaminação de material

5 Transporte Swab Algodão estéril Rayon ou Dracon Alginato de cálcio
Solução salina, meio de cultura Amie (com ou sem carvão),Stuart e Clairy Blair.

6 Swab

7 Amostras rejeitadas Amostra recebida em formalina;
Coleta de escarro de 24 horas; Único swab para vários fins; Recipiente impróprio, contaminado ou com vazamento Placas de cultura com crescimento excessivo ou secas.

8 Fase Analítica Seleção de meios de cultura primários
Transferência e cultura das amostras clinicas Interpretação das culturas e análise dos resultados.

9 Meios de cultura Destinados para a reprodução, isolamento e análise dos microorganismos de interesse medico.

10 Meio de cultura Compostos por
Hidrolisados de proteínas: fonte de C e N Carboidratos: Tampões Enriquecimento Inibidores Indicadores de pH Ágar: agente solidificante Substratos para ação enzimática

11 Meio de cultura não seletivos
Crescimento: Ágar chocolate Ágar sangue Ágar Cled Ágar Mueller Hinton

12 Ágar chocolate: meio nutritivo maioria bactérias, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hematina. Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.  Ágar sangue: meio não seletivo, crescimento de bactérias gram – e + Cled- Ágar cystine lactose eletrolyte deficient: meio que permite o crescimento de gram+ e gram- . Ágar Mueller-Hinton é um meio de cultura microbiológico que é freqüentemente usado para testes de susceptibilidade antimicrobiana.

13 Meio de cultura seletivos
Ágar Manitol Ágar Mac Conkey, EMB Ágar Salmomella Shigella Ágar Sabouraud Ágar Bili-Esculina Ágar Dnase Ágar TSI Ágar Lowestein Jensen

14 Ágar Manitol - Famílias Micrococcaceae
Ágar Mac Conkey, EMB - Crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose Ágar Salmomella Shigella Ágar Sabouraud - Identificação de fungos patogênicos e leveduras. Ágar Bili-Esculina - Isolamento e identificação de estreptococos. Ágar Dnase - Recomendado para a detecção da atividade desoxiribonuclease de bactérias e fungos. Staphylococcus aureus. Ágar TSI - Diferenciação de patógenos entéricos (E. coli) pela capacidade de determinar a fermentação do carboidrato. Ágar Lowestein Jensen - Mycobacterium tuberculosis Azul de Toluidina

15 Caldos : Caldo tetrationato Caldo selenito Caldo nitrato
Caldo malonato Caldo triptona e SIM Caldo BHI

16 Caldo tetrationato Meio de enriquecimento para uso com Salmonella spp
Caldo tetrationato Meio de enriquecimento para uso com Salmonella spp.- Cosposto por sais de bile impede o crescimento de bactérias Gram-positivas e o iodo proporciona o impedimento de crescimento de espécies fecais. Caldo selenito. Diferenciar e identificar vários tipos de bactérias especialmente a família Enterobacteriaceae. Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos. Caldo malonato usado para a diferenciação de bactérias gram-negativas com base na habilidade de utilizar malonato e produzir ácido pirúvico. Caldo triptona e SIM Metabolizar o triptofano em indol. Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e anaeróbios. Caldo BHI. Caldo infusão de cerebro e coração e um meio altamente nutritivo empregado para a propagação de cocos.

17 Meios de cultura: MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO
Ágar Nutriente Salina tamponada Clary Blair Meio Stuart Água peptonada

18

19 Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população.
Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão. Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem. Declínio: A maioria das células está em processo de morte

20 O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo: N=No.2n, onde N= número final de células, No= número inicial de células, n= número de gerações. n= log(N) - log(No)/0.301 g = t/n , onde g= tempo de geração, t= tempo de crescimento e n= determinado acima.

21 Cultura das amostras clínicas:

22

23 Avaliação das colônias
Tamanho: diâmetro em milímetros Forma Elevação Margem Cor: branca, amarela, preta, camurça, laranja... Superfície: brilhante, opaca Densidade: opaca, translúcida, transparente Consistência: viscosa, butirácea, membranosa

24 Avaliação das colônias
Odores: tênis sujo (citrobacter spp.), pútrido ( Clostridium difficile), pêlo molhado ( Haemophillus spp), chocolate queimado ( Proteus spp) Mudanças de cor no meio: indicadores de pH

25 Avaliação das colônias

26 Avaliação das colônias

27 Avaliação das colônias

28 Uso de corantes biológicos
Coloração de Gram Coloração ácido resistente Coloração fluorescente (UV) – fluorocromos (ag/ac) Laranja de acridina Azul de Toluidina – biópsia de pulmão e secreções respiratórias

29 Bacterioscopia Gram Negativa

30

31 Gram positiva

32

33 TÉCNICA DE GRAM Identificação das características bacterianas referente ‘a coloração da parede celular e sua diferenciação em bactérias Gram positivas e Gram negativas; Verificação da forma, arranjo e tamanho das bactérias .

34 Composição dos corantes utilizados:
Solução de cristal violeta Cristal violeta 1g Ácido fênico 2 g Álcool absoluto 10 mL Água destilada 100 mL Lugol Iodo 1 g Iodeto de potássio 2 g Água destilada 300 mL

35 Composição dos corantes utilizados:
Álcool acetona Álcool 800 mL Acetona 200 mL Fucsina Fucsina 2,5 g Álccol etílico 100 mL Água destilada 90 mL

36 Os corantes devem ser armazenados em frasco de vidro âmbar em locais onde as condições do ambiente sejam favoráveis, com temperaturas entre 20 e 25ºC (temperatura ambiente) e sem teor de umidade.

37 Recebimento das amostras
Amostras recebidas em Swab Rolar delicadamente o swab sobre a superfície de uma lâmina limpa Se o swab estiver seco, colocar um pequeno volume de solução fisiológica estéril, agitar vigorosamente, comprimindo-o contra a parede do tubo e utilizar essa suspensão para o preparo do esfregaço. Deixar secar ao ar e fixar ao calor. Corar pelo método de Gram

38 Amostras de aspirado, exsudatos e escarro.
As amostras recebidas em seringa devem ser transferidas para um tubo estéril, homogeneizadas para a execução de um esfregaço em lâmina. Se a amostra for muito espessa, diluir em solução fisiológica estéril antes de fazer o esfregaço. Para as amostras recebidas em frascos ou tubos estéreis, selecionar a parte mais purulenta e confeccionar o esfregaço em lâmina. Espalhar a amostra em ¾ da lâmina e formar o esfregaço fino. Deixar secar ao ar e fixar com calor. Corar pelo método de Gram

39 Esfregaço de colônias Colocar uma pequena gota de solução fisiológica sobre a lâmina. Com a alça bacteriológica, tocar a superfície de uma colônia isolada e emulsionar gentilmente na gota de solução fisiológica colocada sobre a lâmina. Deixar secar ao ar e fixar no calor Corar pelo método de Gram.

40 Amostras que requerem centrifugação
Após centrifugação (3.000 a rpm / 15 min.) remover o sobrenadante e deixar aproximadamente 0,5 mL do sedimento. Homogeneizar e confeccionar o esfregaço (+/- 50 uL do material – 1 gota) Deixar secar ao ar e fixar no calor. Corar pelo método de Gram

41 Técnica de coloração de gram
Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados, “cortando” lentamente a chama do bico de Bunsen; Flambar a alça de platina até o rubor e esfriá-la. Tomar o tubo de cultura com a mão esquerda e com os dedos mínimo e anelar da mão direita remover a tampa do tubo; Flambar a boca do tubo de cultura;

42 Introduzir a alça de platina, apreendida entre o polegar e o indicador da mão direita, no interior do tubo até tocar o meio de cultura Flambar novamente a boca do tubo de cultura; Fechar o tubo e colocá-lo na estante; Tomar uma lâmina (anteriormente preparada) com a mão esquerda e depositar no centro da mesma uma amostra de suspensão bacteriana;

43 Espalhar o material com movimentos de rotação da alça de platina, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme, secar naturalmente; Manter o esfregaço nas proximidades da chama.

44 Fixação: Fixar o esfregaço, “cortando” lentamente a chama por 3 vezes, a fim de que o material fique bem aderente à lâmina. A fixação é sempre feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano.

45 Técnica: Cobrir com cristal violeta e deixar agir por 1 minuto;
Cobrir com solução de lugol por 1 minuto; Lavar com água tomando cuidado pra que o jato não incida diretamente no material a ser analisado. Descorar com álcool acetona;

46 Técnica Lavar com água; Corar com fucsina fenicada por 30 segundos;
Lavar com água, secar e observar em objetiva de 100 x com óleo de imersão.

47 Resultado: Bactéria Gram positiva – roxo escuro
Bactéria Gram negativa – avermelhadas (rosada)

48 Princípio da técnica O cristal violeta cora tanto a parede celular das bactérias Gram + quanto Gram -. O lugol tem ação de fixador, sendo absorvido por ambas, formando assim o complexo cristal violeta-iodo ( CV-I) corando a bactéria de roxo.

49 Princípio da técnica O álcool acetona funciona como um solvente atuando na porção lipídica da parede celular das bactérias Gram -, resultando numa porosidade e permeabilidade aumentada, extraindo desta forma o complexo CV-I, descorando as células.

50 O álcool acetona, desidratando a espessa camada de peptideoglicano das bactérias Gram +, provoca a contração dos poros, retendo desta forma o CV-I, mantendo as células coradas. A última etapa do processo é tratamento com o corante fucsina que cora a parede celular das Gram -, tornado-as avermelhadas ou rosa.

51 Gram positiva

52 Gram negativa