PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES PROVA DE COMPATIBILIDADE

Apresentação em tema: "PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES PROVA DE COMPATIBILIDADE"— Transcrição da apresentação:

1 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES PROVA DE COMPATIBILIDADE
COOMBS DIRETO PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES PROVA DE COMPATIBILIDADE

2 TÉCNICA DO COOMBS DIRETO (CD) OU
TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRETO (TAD) O Teste de Coombs direto (CD) ou teste da Antiglobulina humana direto (TAD), demonstra a presença de hemácias sensibilizadas por anticorpos ou frações do complemento “in vivo”. É utilizado no estudo de diversas patologias:  Doença Hemolítica do Recém-nato. Anemias hemolíticas auto-imune (AHAI) Reação hemolítica transfusional.

3 1. Coletar a amostra de sangue
TÉCNICA DO COOMBS DIRETO (CD) OU TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRETO (TAD)  1.  Coletar a amostra de sangue 2.  Preparar uma suspensão de hemácias à mais ou menos 3-5%. 3.  Colocar uma gota desta suspensão em um tubo de hemólise. 4.  Lavar três vezes com salina fisiológica. 5.  Adicionar 2 gotas da antiglobulina humana poli-específica (anti-IgG e anti-C3d) 6.  Centrifugar 3400 rpm 15 segundos 7.  Ressuspender suavemente o botão de hemácias 8.  Observar a presença ou não de aglutinados 9.  Anotar os resultados AGH Ctl

4 Ausência de aglutinação = Coombs direto negativo
Teste de Coombs direto   Ausência de aglutinação = Coombs direto negativo Presença de aglutinação - Coombs direto positivo Hemácias sensibilizadas “in vivo” por anticorpos ou fracões do Complemento

5 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Fig - B AGH AGH IgG Complemento INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Ocorrendo ausência de aglutinação o teste é negativo – Teste de Coombs direto negativo Ocorrendo aglutinação o teste é positivo - Teste de Coombs direto positivo

6 Ausência de aglutinação Falha Técnica Presença de aglutinação
VALIDAÇÃO DA REAÇÃO COM ANTIGLOBULINA HUMANA Sempre que a AGH for utilizada e necessário a realização do Controle de Coombs 10. Quando a reação for negativa adicionar 1 gota do Reagente Controle de Coombs. 11. Centrifugar e ler O resultado deverá ser agora positivo caso contrário houve falha técnica   Ausência de aglutinação Falha Técnica Presença de aglutinação Validação da reação

7 CAUSAS DE ERRO NA INTERPRETAÇÃO QUANDO UTILIZA-SE A AGH
São causas de reação Falso-positivo: Vidraria mal lavada Centrifugação excessiva Salina contendo partículas de sílica coloidal São causas de reação Falso-negativo: Lavagem inadequada das hemácias Reagente AGH sem reatividade Preparo inadequado das suspensões de hemácias Sub-centrifugação

8 Considerações sobre o teste
O teste de Coombs direto positivo pode não estar associado a Anemia hemolítica auto-imune e ainda assim não ser falso-positivo. 3% dos pacientes que recebem penicilina e 15% dos que recebem alfa-metildopa podem desenvolver Coombs direto positivo mas só 1% destes indivíduos terão Anemia hemolítica Auto-imune. 6 a 8% dos pacientes internados em hospitais podem ter CD positivo sem manifestações clinicas de destruição acelerada das hemácias (Garratty G, Transfusion Medicine Review 1987; 1:47-57) Com os reagentes atuais , cuja sensibilidade é maior para detectar moléculas de imunoglobulinas e Complemento, a possibilidade de encontrarmos teste de Coombs direto positivo sem hemólise é maior.

9 TESTE DE COOMBS DIRETO POLIESPECÍFICO
POSITIVO NEGATIVO SENSIBILIZAÇÃO “IN VIVO” AUSÊNCIA DE SENSIBILIZAÇÃO “IN VIVO” SENSIBILIZAÇÃO NÃO DETECTADA AUTO- ANTICORPOS ALO- ANTICORPOS ELUIÇÃO DIRETA OBRIGATÓRIA NOS CASOS DE REAÇÃO TRANSFUSIONAL COOMBS DIRETO MONOESPECÍFICO IgG / IgM / IgA / Frações do Complemento

10 Sistemas de grupos sanguíneos, genes, localização cromossômica
Símbolo Gene Localização Cromossômica 001 ABO ABO ABO 9q34.1-q34.2 002 MNS MNS GYPA, 4q28-q31 GYPB,GYPE 003 P P1 P1 22q11.2-qter 004 Rh RH RHD,RHCE 1p 005 Lutheran LU LU 19q12-q13 006 Kell KEL KEL 7q33 007 Lewis LE FUT3 19p13.3 008 Duffy FY FY (DARC) 1q22-q23 009 Kidd JK JK 18q11.1-q11.2 010 Diego DI AE1 (SLC3AE1) 17q12-q21 011 Yt YT ACHE 7q22 012 Xg XG XG Xp22.32 013 Scianna SC SC 1p36.2-p22.1

11 Sistemas de grupos sanguíneos, genes, localização cromossômica
Símbolo Gene Localização Cromossômica 014 Dombrock DO DO 12p p12.1 015 Colton CO AQP1 7p14 016 Landsteiner-Wiener LW LW 19p13.2-cen 017 Chido/Rodgers CH/RG C4A, C4B 6p21.3 018 Hh H FUT1 19q13 019 Kx XK XK Xp21.1 020 Gerbich GE GYPC 2q14-q21 021 Cromer CROM DAF 1q32 022 Knops KN CR1 1q32 023 Indian IN CD44 11p13 024 Ok OK CD147 10pter-p13.2 025 Raph RAPH MER2 11p15.5

12 Sistemas de grupos sanguíneos, genes, localização cromossômica
Símbolo Gene Localização Cromossômica 026 John Milton Hagen JMH SEMA7A 15q23-q24 027 I I CGNT2 6p24 028 Globoside GLOB LW 3q25 029 GIL GIL AQP3 9p13

13 Inserção das Proteínas na Membrana Eritrocitária
MNSs Knops Gerbich LW Indian Xg Lutheran Cromer Yt Dombrock JMH* Kell NH2 NH2 COOH ABO H Lea/Leb P1 P+ I,I* Rh Diego Duffy Colton Kx Kidd NH2 Exofacial CHO Endofacial COOH GPI-linked NH2 Multipass COOH Single-pass

14 Fy LW Lu Ina/Inb Jk Urea transporter Cytokine receptor Cell adhesion
(CD44) Jk Urea transporter Cytokine receptor Cell adhesion molecules Transport proteins Surface enzymes Xk Kell Yt (AChE) Cromer (CD55,DAF) Kn (CR1) Complement Control

15 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
(PAI) A Pesquisa de anticorpos irregulares é realizada em doadores de sangue e na seleção pré-transfusional. Ao procedermos a PAI submetemos o soro ou plasma a testar a pelo menos 2 hemácias do Grupo “O” com perfil antigênico conhecido e documentado no Diagrama de antígenos incluso no Kit. Devemos aplicar técnicas que revelem anticorpos sensibilizantes, aglutinantes e hemolizantes. Em caso de positividade deveremos proceder a identificação destes anticorpos. I II

16 Diagrama de Antígenos I II Lote: Validade:  Observações:

17 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES Técnica de Coombs albuminoso
Fase Salina Imediata: Esta fase revela anticorpos frios de natureza IgM em geral. (anti-M, anti-P, anti-Lea) Rotular dois tubos de hemólise como I e II; Nos dois tubos, colocar duas gotas de soro a ser testado; No tubo I, adicionar 1 gota de suspensão a 5% de hemácias de triagem I e no tubo II, idem para hemácia de triagem II; Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos; Observar o sobrenadante para hemólise. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para aglutinação; Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação); I II      

18 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
Fase albumina imediata A albumina é uma proteína que atua aumentando a constante dielétrica do meio, diminui o potencial zeta e facilita a aglutinação. Nesta fase alguns anticorpos de natureza IgG já podem ser revelados. Detecta a presença de anticorpos para o sistema Rh e ocasionalmente anti-K e anti-Fya. A cada um dos tubos I e II, adicionar duas gotas de Albumina bovina a 22%; Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos; Observar o sobrenadante para hemólise. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para aglutinação; Alb Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação); I II    

19 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
Fase Térmica Este artifício físico auxilia na revelação de anticorpos IgG. Quando os tubos são incubados a 370C, são revelados anticorpos, através de aglutinação (anti-D, anti-K) ou de hemólise (anti-Lea). Incubar ambos os tubos durante 15 minutos, em banho-Maria a 370C; Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos; Observar o sobrenadante para hemólise. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para aglutinação; Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação);

20 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES
Fase anti-globulina humana (Coombs indireto) Esta é uma fase onde através da antiglobulina humana que é um artifício imunológico se revela a aglutinação de hemácias sensibilizadas por IgG. São revelados a maioria dos anticorpos ( anticorpos quentes). Lavar as hemácias dos tubos I e II, em salina, por três vezes; Após a terceira lavagem, retirar todo o sobrenadante por inversão rápida dos tubos; Agitar bem e adicionar a cada tubo, duas gotas da anti-globulina humana Misturar bem e centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos; Observar o sobrenadante para hemólise. Ressuspender delicadamente o "botão" de hemácias e ler macroscopicamente para aglutinação; Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação); Validação da AGH Nos tubos negativos, adicionar uma gota do Reagente Controle de Coombs; Misturar bem, centrifugar adequadamente, ressuspender gentilmente o "botão de hemácias" e ler macroscopicamente para aglutinação, a qual deverá forçosamente ocorrer.

21 Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação);
II FASE ANTI-GLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO) AGH D D Ctl D Ctl Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação); I II    

22 PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR (PCM) Técnica Coombs albuminoso em tubo
A Prova de Compatibilidade (PC) ou Prova Cruzada consiste em, antes da transfusão, colocar em contacto o soro do receptor com os GV do doador (PCM-maior) e o soro do doador com os GV do receptor (Pcm-menor), afim de assegurar ao receptor um sangue compatível. A técnica utilizada deve revelar anticorpos sensibilizantes, aglutinantes e hemolizantes Separar uma amostra do segmento da bolsa selecionada ABO compatível Preparar uma suspensão de hemácias de a 5% adicionando em um tubo de hemólise: 1 gota do concentrado de hemácias gotas de salina

23 PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR Fase de leitura imediata:
Para cada unidade de sangue a testar, identificar um tubo como PC 1 Colocar duas gotas de soro do paciente, e 1 gota de GV a 5% da bolsa selecionanda; Centrifugar o tubo a rpm por um minuto ou rpm por 15 segundos; Observar a presença de hemólise ou aglutinação. Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação); PC 1   

24 FASE ALBUMINA IMEDIATA
Adicionar duas gotas de Albumina bovina a 22%; Centrifugar o tubo a rpm por um minuto ou rpm por 15 segundos; Observar a presença de hemólise ou aglutinação. Alb Anotar os resultados em cruzes (intensidade de aglutinação); PC 1  

25 PROVA DE COMPATIBILIDADE MAIOR
FASE TÉRMICA Incubar em banho-Maria a 370C durante 15 minutos, no mínimo; Centrifugar o tubo a rpm por um minuto ou rpm por 15 segundos; Observar a presença de hemólise ou aglutinação. Anotar o resultado; FASE DA ANTIGLOBULINA HUMANA Preencher o tubo com salina, centrifugar a rpm durante 1 minuto e 30 segundos e decantar o sobrenadante. Repetir essa lavagem por 3 vezes e após a última lavagem decantar o sobrenadante o mais completamente possível; Adicionar duas gotas de AGH, homogeneizar bem; Centrifugar a rpm por 15" ou a rpm por um minuto. Examinar macroscopicamente para aglutinação. Anotar os resultados; Validação da AGH Sendo ausente a aglutinação, colocar no tubo, uma gota do Reagente Controle Coombs; A reação com o Controle de Coombs deverá ser positiva.

26 Presença de aglutinação PROVA INCOMPATÍVEL  
PC 1 AGH FASE ANTI-GLOBULINA HUMANA (COOMBS INDIRETO) D D Ctl D Ctl Presença de aglutinação PROVA INCOMPATÍVEL PC 1 PC 1   PC 1 Ausência de aglutinação PROVA COMPATÍVEL

27 = Reatividade aumenta com o aquecimento
Ao analisarmos um painel também e importante termos em mente o COMPORTAMENTO DO ANTICORPO de determinados anticorpos. Assim são importantes a temperatura ideal, a melhor técnica de revelação e o comportamento dos antígenos correspndentes frente ao tratamento enzimático. Reatividade Temperatura Fase de Enzima 4ºC ºC ºC Coombs ºC Especificidade do Natureza do Ac Anticorpo Anti-D Anti-C Anti-c Anti-E Anti-e Anti-Cw Anti-K Anti-k Anti-Jka Anti-Jkb Anti-Jk3 Anti-Fya Anti-Fyb Anti-Fy3 Natural Imune Não Sim Sim Sim Sim Sim Positivo Aumenta Pode Aumentar Diminui = Reatividade aumenta com o aquecimento

28 = Reatividade aumenta com o aquecimento
COMPORTAMENTO DO ANTICORPO Reatividade Temperatura Fase de Enzima 4ºC ºC ºC Coombs ºC Especificidade do Natureza do Ac Anticorpo Anti-S Anti-s Anti-M Anti-N Anti-U Anti-Lea Anti-Leb Anti-Lex Anti-Lua Anti-Lub Anti-P1 Anti-P Anti-Tja Natural Imune Sim Sim Não Sim Sim Alguns Sim Sim Sim Não Sim Raro Raro Sim Positivo Pos/ Neg Diminui Aumenta Variável = Reatividade aumenta com o aquecimento = Reatividade diminui com o aquecimento

29 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES POSITIVA + AUTO-CONTROLE NEGATIVO
O fluxograma abaixo fornece diretrizes para a interpretacao de paineis de hemacias PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES POSITIVA + AUTO-CONTROLE NEGATIVO TODAS REAÇÕES POSITIVAS COM MESMA INTENSIDADE E FASE REATIVIDADE COM ALGUMAS CÉLULAS PARECENDO ELIMINAR TODAS ESPECIFICIDADES SOMENTE UMA CÉLULA DO PAINEL POSITIVA OU SOMENTE A PROVA CRUZADA INCOMPATÍVEL ANTICORPO CONTRA ANTÍGENO PÚBLICO BAIXA REATIVIDADE DO ANTICORPO OU EFEITO DE DOSE ANTICORPO CONTRA ANTÍGENO PRIVADO SOMENTE UMA CÉLULA DO PAINEL POSITIVA BOLSA COM COOMBS DIRETO POSITIVO SOMENTE A PROVA CRUZADA INCOMPATÍVEL PAINÉIS ESPECIAIS FENOTIPAR O PACIENTE PAINÉIS ESPECIAIS TÉCNICAS QUE AUMENTAM A ATIVIDADE DOS ANTICORPOS TITULAÇÃO DE ANTICORPOS PAINÉIS ESPECIAIS COOMBS DIRETO DA BOLSA

30 Ao definirmos as especificidades envolvidas na interpretação de painéis de hemácias, é importante termos conhecimento da IMPORTÂNCIA CLINICA DESTES ALO-ANTICORPOS: ANTICORPOS CLINICAMENTE SIGNIFICANTES Os anticorpos dos Sistemas ABO , RH , KELL , KIDD , DUFFY e contra os antígenos SsU devem ser respeitados no caso de necessidade transfusional. ANTICORPOS QUE PODEM SER SIGNIFICANTES Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Lea , M , N , P1, Lua , Lub podem ocasionalmente determinar reação transfusional ANTICORPOS QUE RARAMENTE SÃO SIGNIFICANTES Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Leb , Cha , Rga , Xga e os dirigidos contra antígenos de alto titulo e baixa afinidade ( HTLA ) dificilmente estão envolvidos em problemas transfusionais