“O índice de câncer hepático na África – grande consumidor de amendoim, um grão altamente contaminável – é 13 vezes maior que em outros países” (SANTURIO, 2004) Fungo Aspergillus se desenvolve principalmente no milho “A presença da aflatoxina nos alimentos contribui sobremaneira para mais de um terço dos casos de neoplasias que tenha relação com a dieta” (CIB, 2004) MICOTOXINAS

MICOTOXINAS “Conjunto complexo de substâncias tóxicas, produzidas por fungos, diferenciando-se das toxinas bacterianas por não terem natureza protéica nem serem imunogênicas” . Imunógeno Uma substância que induz uma resposta imune específica. Antígeno (Ag) Uma substância que reage com os produtos de uma resposta imune específica.

HISTÓRICO 10 pragas do Egito – evidências de micotoxinas: morte dos primogênitos; Europa/Idade Média- Fogo de Santo Antonio : ergotismo (Claviceps purpurea); Rússia/séc.XIX: aleucia alimentar tóxica- angina, cefaléia, vômitos e, em casos mais graves, a leucopenia seguida de hemorragia e morte- tricotecenos do Fusarium (matou 100 mil russos); Inglaterra/1960: morte de 100mil perus que comeram farinha de amendoim com toxinas procedente do Brasil. 1957 e 1968 - Nefropatia no leste europeu- alimentos com ocratoxina. A história das micotoxinas começa em 1960, quando um surto de mortes inexplicáveis de aves no Reino Unido (especialmente perus) é investigado. O surto ficou mundialmente conhecido como 'turkey X disease'. Chega-se à conclusão que o problema estava na ração, que havia sido feita com amendoim importado da África e do Brasil. Esse amendoim estava contaminado com uma substância fluorescente produzida pelo fungo Aspergillus flavus. Da expressão inglesa 'A. flavus toxin' derivou a palavra AFLATOXINA. Hoje se sabe que não existe uma aflatoxina, mas pelo menos 17 compostos tóxicos, dentre os quais os mais importantes são as aflatoxinas B1, G1, B2 e G2. E destas, a aflatoxina B1 (AFB1) é considerada o agente natural mais carcinogênico que se conhece. Por conta disso e pela prevalência deste fungo (e de outras espécies produtoras) em nosso meio, é a mais importante micotoxina no Brasil. É importante lembrar que, a partir de 1962, quando se estabeleceu as causas do surto, pesquisas subseqüentes encontraram outros fungos produtores de substâncias tóxicas diferentes.

25% da safra mundial de grãos é perdida em função de fungos e micotoxinas Perda na produção de amendoim já foi de 50% por causa da aflatoxina Mais de 500 micotoxinas conhecidas e produzidas por cerca de 100 espécies de fungos pertencentes, principalmente, aos gêneros Aspergillus, Alternaria, Fusarium e Penicillium.

Quando, onde e como são produzidas? Produtos agrícolas estão sempre predispostos e susceptíveis à contaminação por micotoxinas durante: a colheita; a estocagem; o transporte; o processamento; a armazenagem. Ausência de fungos não implica na ausência de micotoxinas

A ocorrência de micotoxinas depende de fatores extrínsecos e intrínsecos Estação do ano; Condições de cultivo e colheita; Armazenagem; Região e Clima. Intrínsecos Produto vegetal; Microbiota natural e contaminante; Umidade relativa e atividade de água; Temperatura; Infestação por insetos; % de integridade dos grãos.

Fungos Toxígenos Aspergillus Fusarium Penicillium

Principais substratos Principais fungos produtores Principais micotoxinas com seus respectivos fungos produtores, substratos e efeitos no homem e nos animais. Principais substratos Principais fungos produtores Principal toxina Efeitos Amendoim, milho Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus Aflatoxina B1 Hepatotóxica, nefrotóxica, carcinogênica. Trigo, aveia, cevada, milho e arroz Penicillium citrinum Citrinina Nefrotóxica para suínos Centeio e grãos em geral Claviceps purpurea Ergotamina Gangrena de extremidades ou convulsões Milho Fusarium verticillioides Fumonisinas Câncer de esôfago Cevada, café, vinho Aspergillus ochraceus e  Aspergillus carbonarius Ocratoxina Frutas e sucos de frutas Penicillium expansum e Penicillium griseofulvum Patulina Toxicidade vagamente estabelecida Milho, cevada, aveia, trigo, centeio Fusarium sp; Trichothecium sp Tricotecenos Hemorragias, vômitos, dermatites Cereais Fusarium graminearum Zearalenona Baixa toxicidade; síndrome de masculinização e feminização em suínos

principais Micotoxinas AFLATOXINAS B1 e B2 = Fluorescência azul (Blue em UV); G1 e G2= Fluorescência verde (Green em UV); M= (leite- milk) OCRATOXINA ZEARALENONA FUMONISINAS TRICOTECENOS: DEOXINIVALENOL (DON), T-2, HT-2, NIVALENOL PATULINA

AFLATOXINAS B1,B2,G1,G2, M1e M2; são furocumarinas complexas com intensa fluorescência sob luz ultravioleta; B – fluorescência azul G – fluorescência verde são substâncias cristalinas, apolares (metanol, clorofórmio, tolueno); altamente estáveis na ausência de luz UV e a temperaturas acima de 100ºC (TERMOESTÁVEIS)

Espécies produtoras Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Temperatura crescimento: 12-42ºC, com ótima a 32ºC; Aw mínimo 0,80 a 37ºC; Países tropicais e subtropicais.

Aflatoxinas Aflatoxina B1 Substância hepatocarcinogênica, mutagênica Pertencente ao Grupo1: carcinogênico para humanos (IARC/1993) Aflatoxina M1 Quando o gado leiteiro é alimentado com ração contaminada com AFB1, parte desta toxina pode ser convertida em um derivado hidroxilado, que pode ser secretada no leite Presente no leite e produtos derivados Grupo 2B: agente possivelmente carcinogênico (IARC, 1993)

Dados da incidência de aflatoxinas em diferentes alimentos ingeridos pela população brasileira (Rodriguez- Amaya & Sabino, 2002).

Micotoxina Toxicocinética Trato gastrointestinal Fezes Substâncias lipossolúveis, absorvidas no duodeno por difusão passiva Trato gastrointestinal Fezes Sistema porta-hepático Fígado Bile Músculo Leite, ovos Sistema circulatório do sangue Rim Urina

Metabolismo

Wild C , Turner P Mutagenesis 2002;17:471-481

Aspectos toxicológicos das aflatoxinas Micotoxinas estão, em geral, presentes em concentrações muito baixas (ppb), que passam desapercebidas por quem ingere o alimentos, em virtude de não alterarem suas propriedades organolépticas. Entretanto, em países com escassez de alimentos e nos quais a população passa fome, a qualidade do alimento é a última coisa a se considerar. Nestes países, a prevalência de efeitos tóxicos agudos (micotoxicoses), ou crônicos (carcinoma hepático) é mais elevada.

AFLATOXICOSES – Intoxicações agudas Alterações hepáticas 1,0 ppm Hemorragias na musculatura Aflatoxicose aguda

AFLATOXICOSES – Intoxicações agudas Sintomas após ingestão, durante 3 semanas, de arroz contaminado com aflatoxinas com concentrações de 200 mg/Kg: Edema de membros inferiores; Dores abdominais; Vômitos; Hepatomegalia; Necrose hepática; Esteatose; Hipoglicemia; Hiperamonemia; Convulsões. Já foi relatado um caso letal de uma criança de 3 anos, envolvida com a ingestão de arroz mofado contendo 10 mg de aflatoxinas/Kg de alimento.

Aflatoxinas em rações AVES:  Inibição do crescimento;  Inibição dos mecanismos de resistência imunológica;  diminuição da produção de ovos;  sensibilidade a machucaduras. BOVINOS:  Alterações reprodutivas (redução);  redução de peso;  redução da produção leiteira;  contaminação do leite (Afla M1) SUÍNOS:  Alterações reprodutivas (infertilidade e abortos);  redução do crescimento;

CARCINOGENICIDADE DAS AFLATOXINAS É através da alta frequência de ingestão de alimentos contaminados com baixos teores de micotoxinas (ng/g ou ppb), que reside o maior risco para a população exposta; Existe relação causal entre ingestão de aflatoxina e câncer hepático. Dois tipos de interações com ácidos nucléicos podem ocorrer: ligação não- covalente, reversível, e formação de ligação covalente, irreversível, necessitando de ativação metabólica. O composto tóxico é o derivado 8,9- epóxido.

O 8,9-epóxido da Aflatoxina B1 forma um aduto com a guanina no DNA

Este produto (aduto) leva a uma quebra da ligação entre a base e o açúcar, resultando em um sítio apurínico. Normalmente, adeninas são introduzidas em sítios apurínicos, levando a uma mutação no DNA. G:C → 0:C → 0:A 0:A → T:A Ou seja, a ligação do metabólito tóxico da Aflatoxina ao DNA leva a uma transversão G:C → T:A, causando uma mutação no DNA. É esta mutação que ocasiona o câncer.

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011 (publicado em 22 de fevereiro de 2010 no Diário Oficial da União nº 37, pagina 72-73)

OCRATOXINA Amidas da L-ß fenilalanina com isocumarinas; Composto incolor e cristalino; Solúvel em solventes orgânicos polares e ligeiramente solúveis em água.

Principais Fungos Produtores - Ocratoxina Penicillium verrucosum - Países de clima temperado - T ótima = 20ºC - aw mínimo = 0,80 - comum em cereais, queijo, cerveja Aspergillus ochraceus - T ótima = 24 - 31ºC - aw min = 0,77 a 25ºC - Alimentos de Aw (grãos, cereais, milho,soja)

Principais Fungos Produtores - Ocratoxina Aspergillus carbonarius - T ótima = 32 – 35ºC; - Frutas secas, uva, vinho, café; - Nefrotóxica e nefrocarcinogênica; - Nefropatia endêmica dos Balcãs.

OCRATOXINA NO CAFÉ Aspergillus ochraceus e Penicillium verrucosum – Algumas populações européias registram alta incidência de nefropatias decorrentes da ingestão da ocratoxina A. Quantidade de ocratoxina que ingerimos é diminuída pois: O café não é consumido em grãos; Torração elimina 90% da toxina; Filtragem do pó retém parte da toxina.

Aspectos toxicológicos - Ocratoxina Lipossolúvel, comporta-se como eletrólito fraco, sendo mais absorvida no estômago e duodeno. Sofre efeito de primeira passagem (fígado) Os rins são os órgãos onde a Ocratoxina mais se distribui Excreção renal da forma biotransformada e fecal É nefrotóxica e nefrocarcinogênica Parece estar associada com a nefropatia endêmica dos Balcãs – observada nas zonas rurais da Bulgária, Romênia e Ioguslávia. Índices de toxicidade: Ingestão Semanal Aceitável provisória= 0,1 µg/Kg peso corporal

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011 (publicado em 22 de fevereiro de 2010 no Diário Oficial da União nº 37, pagina 72-73)

Aplicação imediata Limite máximo tolerado (ppb)

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011

FUMONISINAS FB1, FB2 e FB3 São poliálcoois, esterificados com ácido carboxílico 1,2,3; Baixa lipossolubilidade; Fungos produtores: Fusarium verticillioides; Fusarium proliferatum Contaminantes do milho, principalmente

Aspectos toxicológicos - fumonisinas Milho contaminado com fumonisinas destinados à alimentação humana tem sido associado com uma alta incidência de câncer de esôfago em populações do Sul da África, podendo também exercer importante promoção de câncer hepático em algumas regiões da China. Classe 2B – substâncias potencialmente carcinogênicas

FUMONISINAS- Leucoencefalomalacia (LEME)

Leucoencefalomalacia (LEME) Esta afecção é caracterizada por necrose da substância branca de um ou dos dois hemisférios cerebrais. De aparecimento súbito, cursa com anorexia, depressão, andar em círculos, tonteira , comprometimento da visão, hiperexcitabilidade, decúbito e morte após poucas horas ou até 48 horas do início dos sintomas, sendo esta uma característica comum da LEM A leucoencefalomalácia ( L E M ), doença neurotóxica fatal que acomete eqüinos, é causada pela ingestão de alimentos mofados .

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011 (publicado em 22 de fevereiro de 2010 no Diário Oficial da União nº 37, pagina 72-73) Aplicação imediata Limite máximo tolerado (ppb)

ZEARALENONA Intermediário da síntese de hormônios e promotores de crescimento; Patógeno de plantas; T ótima = 24-26ºC; Aw mín = 0,90; Fungos produtores: Fusarium graminearum.

Manifestações clínicas Ocorrência Principalmente milho Cevada, aveia, sorgo, trigo, arroz. Ação biológica Está relacionada com a capacidade de competir com o receptor do estradiol – hormônio sexual Manifestações clínicas Estrogenismo em fêmeas: inchaço e avermelhamento da vulva; inflamação uterina; aumento da secreção vaginal., atrofia dos ovários, atrofia dos testículos – infertilidade. Pode causar o crescimento e lactação das glândulas mamárias em machos e em fêmeas.

Tricotecenos Produzidos por espécies do gênero Fusarium Compreendem mais de 170 compostos: Desoxinivalenol Encontrados em: arroz, trigo, aveia, centeio, sorgo, amendoim, feno, produtos processados tipo “corn flakes”

Manifestações Clínicas Ação biológica Tricotecenos são substâncias com potente ação irritativa local: Inibem a peptidiltransferase (síntese protéica); inibem a produção de energia, o que afeta funcionamento das membranas celulares; Atuam sobre as aminas biogênicas no cérebro Manifestações Clínicas Irritação local da pele e mucosas; Alterações neurológicas (recusa da alimentação e desorientação do vôo em aves) Hemorragia Aplasia medular (destruição da medula óssea) Imunossupressão

Tricotecenos: Armas biológicas???? Em setembro de 1981, a Secretaria de Estado norte-americana declarou publicamente ter evidências do uso militar de potentes micotoxinas no Sudeste Asiático. Segundo o Departamento de Estado, a vegetação do Campuchéa estava contaminada, ao nível de ppm, por três micotoxinas do grupo dos tricotecenos, substâncias produzidas por fungos do gênero Fusarium . Os EUA alegaram, na ocasião, que se tratava de agressão química por parte da União Soviética. Este episódio ficou conhecido como o da Chuva Amarela (Yellow Rain). Uma grande controvérsia se estabeleceu entre cientistas norte-americanos e canadenses, com acirrada polêmica sobre a possibilidade de se tratar de uso militar de toxinas ou de ocorrência de tricotecenos ligada a algum evento natural. Para complicar, logo se evidenciaram discrepâncias entre a história governamental e os fatos experimentais. Um laboratório do Exército constatou 20 casos positivos em 60 amostras de sangue, urina e tecidos. Porém, suspeitou-se que as toxinas encontradas resultassem da ingestão recente de alimentos mofados. Finalmente, foi proposto que as contaminações provinham de fezes de abelhas (que defecavam durante o vôo) na forma de "densas misturas com pólen e outros materiais” Fonte: http://www.nossofuturoroubado.com.br/arquivos/abril_09/bbs_de_quimica.html

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011

Patulina Produzida por diversas espécies de Aspergillus, Penicillium e Byssochlamys Principal espécie: Penicillium expansum – contaminante de maçã e outras frutas Solúvel em água O fungo pode ser encontrado na parte íntegra do fruto, mas para que se desenvolva e produza a micotoxina, é necessário que o fruto esteja danificado por danos físicos ou ataque de microrganismos ou larvas e insetos.

Patulina Os fungos produtores de patulina dificilmente são destruídos pelo aumento da temperatura, pois formam ascósporos. Assim células sobreviventes podem produzir a micotoxina no produto final, ou seja, no suco de maçã. Para prevenir contaminação por patulina: Utilizar frutos de boa qualidade Aplicar nos frutos anidrido sulfuroso – inativa patulina Pasteurização remove até 4% Despectinização – até 1,6% Concentração – até 18%

Aspectos toxicológicos - Patulina Intoxicações agudas: Edema pulmonar Processos hemorrágicos Danos nos capilares hepáticos, do baço e dos rins Edema cerebral Possui provável atividade carcinogênica

Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro 2011

Níveis de toxinas em alimentos e grãos permitidos em diferentes países País/Produto Micotoxina Limite – ppb ou µg/kg Argentina Alimentos infantis B1 Amendoim, milho e derivados B1B2G1G2 5 20 Farelo de soja 30 Leite in natura e em pó M1 0,05 Produtos lácteos 0,5 Uruguai 3 Leite e derivados Amendoim, soja e frutas secas Milho e cevada zearalenona 200 Arroz, cevada, café e milho ocratoxina 50 CE- Comunidade Européia Cereais em geral, frutas secas, condimentos 4 Leite fluido

Níveis de toxinas em alimentos e grãos permitidos em diferentes países País/Produto Micotoxina Limite – ppb ou µg/kg Estados Unidos Rações de crescimento - aves e suínos B1B2G1G2 zearalenona 20 2 Ração final – suínos 200 Produtos lácteos M1 0,5 MERCOSUL Milho Farelo de milho Amendoim e subprodutos BRASIL (Res. RDC 274, 2002) Leite fluido, amendoim e milho Leite em pó 5 Alimentos para consumo humano (somatório das 4 aflatoxinas) Matérias primas e rações- (Portaria MA/SNAD/SFA 07 de 09/11/88). 50 Fonte: FONSECA ( Micotoxinas), BAKKER-ARKEMA(1999); CIB, 2004.

Como eliminar a micotoxina do alimento? A melhor maneira de se controlar a presença de micotoxinas em alimentos é evitar sua formação – controlar crescimento fungos Processos físicos: Limpeza de grãos (remocão de fumonisinas em milho) Temperaturas acima de 150-220º C Microondas em alta potência Processos químicos Ácidos, bases, peróxido de hidrogênio, bissulfito de sódio – descontaminação química de rações Figos secos têm sido descontaminados com bissulfito de sódio e com peróxido de hidrogênio – destrói aflatoxinas e desoxivalenol

Como eliminar a micotoxina do alimento? Processos biológicos: Destruição de aflatoxinas por microrganismos como Flavobacterium aurantiacum e cepas não produtoras de Aspergillus flavus. Processamento dos alimentos Refinação de óleos (↓ aflatoxina) Torrefação do café (↓ ocratoxina) Filtração do pó do café (↓ ocratoxina) Concentração do suco de maçã (↓ patulina) Moagem de milho em meio úmido (↓ zearalenona, aflatoxinas e fumonisinas em amido) Produção da cerveja (a ocratoxina no malte é totalmente destruída)

Controle Biológico Uma cepa competitiva de A. flavus que não produz aflatoxina é aplicada nas plantações de amendoim. Esta cepa se prolifera e compete com a cepa produtora de aflatoxinas, diminuindo a quantidade desta última.

PROBLEMA: Fungo Aspergillus se beneficia do ataque de insetos e libera micotoxinas SOLUÇÃO: Já existe um milho geneticamente modificado que contém um gene da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), o qual faz a planta produzir uma proteína tóxica para determinados insetos, reduzindo os ataques em até 90%.

micotoxinas Métodos de Análises Como eliminar a micotoxina do alimento? Calor seco: somente T > 200 ºC pois são termorresistentes Calor úmido: autoclavagem a 121ºC/4h ocorre redução significativa Extração com solventes: uso de clorofórmios, acetona, somente para fins analíticos Tratamento com solução alcalina: neutralização com álcali Oxidação: tratamento com hipoclorito de sódio 5% Métodos de Análises

Método ideal Um método ideal – eficiente e adequado – para análise de micotoxinas deve ser simples, rápido, preciso, barato, automatizado, sensível e seletivo. A seqüência analítica básica para a maioria dos métodos químicos usados em análise de micotoxinas é: (a) preparo das amostras; (b) extração; (c) limpeza; (d) detecção e quantificação e (e) confirmação.

Etapas da pesquisa de micotoxinas em alimentos A. Preparo da amostra; B. Extração; C. Limpeza: remoção de interferentes; D. Detecção e quantificação; E. Confirmação.

A. PREPARO DE AMOSTRA A coleta da amostra e seu preparo é o passo mais importante no procedimento de análise das micotoxinas. Ela deve ser representativa do lote a ser analisado. Instruções básicas na coleta de amostras para a detecção da presença de micotoxinas: publicadas pela AOAC – Association of Official Analytical Chemists; Acondicionamento: amostras devem ser acondicionadas de modo que se evite a produção de toxinas após a coleta; Para a análise, a sub-amostra é removida da amostra triturada, e a aflatoxina é extraída e quantificada.

A. PREPARO DE AMOSTRA A amostragem é, indubitavelmente, o fator mais importante para a variação verificada nas análises de aflatoxinas em produtos agrícolas em grãos. Este fato é devido à distribuição extremamente desuniforme das aflatoxinas nos produtos agrícolas não processados; Devido à heterogeneidade, os alimentos foram classificados de acordo com a possível distribuição das toxinas: - Tipo I – Alimento onde é esperado alto grau de heterogeneidade de contaminação: grãos, sementes, nozes, frutas secas, grãos grosseiramente triturados; - Tipo II – Alimento onde é esperado exibir contaminação homogênea: líquidos e pó; - Tipo III – Alimento que exibe heterogeneidade intermediária: farinhas, pastas, tortas de oleaginosas e cereais secos (SCUSSEL,1998).

b. Extração Solventes usados: clorofórmio, acetona, metanol, acetonitrila, benzeno, acetato de etila, hexano e água; Muitas micotoxinas são solúveis em solventes orgânicos, mas pouco solúveis em água. A extração é freqüentemente aumentada pela água, que no caso de cereais, por exemplo, “dilata e amolece” as células, facilitando a penetração e a extração pelos solventes orgânicos. Para extração de lipídeos: hexano; Técnicas físicas empregadas: agitação em alta velocidade durantes alguns minutos ou agitação vigorosa por no mínimo 30min; Filtração: para remover a parte sólida. A eficiência na extração da micotoxina depende do bom contato interno entre o solvente e a amostra. Muitas micotoxinas são facilmente solúveis em vários solventes orgânicos, mas pouco solúveis em água. A extração é freqüentemente aumentada pela água, que no caso de cereais, por exemplo, “dilata e amolece” as células, facilitando a penetração e a extração pelos solventes orgânicos (SABINO, 1995). Amostras ricas em lipídios exigem normalmente a retirada dos mesmos. Isso pode ser feito antes, durante ou após a extração. Hidrocarbonetos alifáticos como o hexano é um solvente adequado para tal (SABINO, 1995). O tamanho da partícula da amostra é importante e pode afetar na quantidade total de micotoxina extraída, bem como na reprodutibilidade dos resultados (BARNI, 2001). Após a extração, a filtração é necessária para remover a parte sólida da amostra. Entretanto, em certos tipos de amostra, o filtrado não fica límpido. Quando se utiliza na extração solvente hidrófilo, uma prática comum é adicionar terra diatomácea no filtro para ajudar a filtração, tendo a certeza de que não absorverá o analito (micotoxina). A centrifugação é uma alternativa quando há dificuldade na filtração (BARNI, 2001).

C. Limpeza: remoção de interferentes As técnicas mais comuns de limpeza são extração de gordura, cromatografia de coluna, precipitação e partição líquido-líquido; Após a limpeza, concentrar: através de um banho de água sob pressão reduzida em um evaporador rotatório, ou utilizar um banho de água sob nitrogênio, banho-maria (temperatura sempre inferior a 50ºC). A técnica de precipitação ocorre quando certos compostos químicos, na fase coloidal, são adicionados ao extrato cru e adsorvem pigmentos, proteínas e outros interferentes sobre as suas superfícies. Os complexos assim formados precipitam e podem ser separados por filtração, deixando uma solução limpa. Os agentes precipitantes utilizados são sulfato de cobre, sulfato de amônia, acetato de chumbo e gel férrico. A limpeza por partição líquido-líquido é comumente usada em conjunto com um dos outros procedimentos de limpeza e também transfere toxinas de um solvente para outro. É normalmente realizada em funil de separação contendo dois solventes imiscíveis. Os solventes são selecionados de tal maneira que as micotoxinas sejam, preferencialmente, particionadas em um dos solventes.

d. Detecção e quantificação Maioria utiliza a CCD para quantificar: sensível e de baixo custo, várias amostras simultaneamente. A quantificação na CCD é feita através de comparação visual da intensidade de fluorescência da amostra com a do padrão. O tratamento da cromatoplaca com vários reagentes é largamente usado para identificação de micotoxinas, por exemplo: ao vaporizar a cromatoplaca com H2SO4 50% ou ácido trifluoroacético (TFA) para as amostras positivas, as manchas apresentando cores características para aflatoxinas mudam para amarelo. Se negativo, as cores não mudam de cor. E. Confirmação O anticorpo é específico para AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2 método CLAE com detector de fluorescência usando colunas de imunoafinidade (AFLAPREP®) para clean-up das amostras e derivatização pós-coluna para as AFB1 e AFG1 com célula eletroquímica KOBRA® Cell

Outros métodos de detecção de micotoxinas continuação

Detecção e quantificação Técnicas físico químicas: CCD (Cromatografia em camada delgada); CLAE (Cromatografia líquida de alta eficiência); Técnicas biológicas: imunoensaios Radioimunoensaio (RIA)*- utiliza isótopos radioativos; Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)*; imunoafinidade que é uma técnica cromatográfica baseada diretamente na ligação antígeno com anticorpo fixado numa coluna de cromatografia). *baseadas na competição de ligação entre toxina não marcada proveniente da amostra e a toxina marcada sobre locais específicos do anticorpo Muitas destas técnicas são dispendiosas, demoradas, de execução complexa e requerem instrumentação sofisticada. A disponibilidade de métodos de análise tem disputado um papel chave nos levantamentos da incidência de micotoxinas que estão usualmente presentes em produtos agrícolas e seus derivados como menores constituintes, em concentrações que variam de ng a mg/g. Suas análises, portanto, exigem técnicas analíticas de traços, ou seja, métodos de alta sensibilidade. Outros testes simples, tais como o do tipo cartão também foram desenvolvidos, onde o anticorpo é imobilizado em uma pequena depressão do cartão (tamanho semelhante ao de um cartão de crédito). Várias micotoxinas, 23 incluindo a aflatoxina, zearalenona, toxina T-2 e ocratoxina A podem ser determinadas por este teste. Um número considerável de kits para aflatoxinas, de diversas marcas, tem sido comercializado. Embora a maioria deles tenha dado resultados satisfatórios quando comparados com métodos oficiais/aprovados, a avaliação destes kits pode levar a controvérsias. Estudos colaborativos (baseados na especificidade, sensibilidade, aplicabilidade, estabilidade, quantidades de controles, custo, precisão, acuidade e simplicidade) têm sido realizados. Inclusive a AOAC possui um instituto de pesquisa especialmente para testar kits comerciais e os em desenvolvimento (SCUSSEL, 1998).

CROMATOGRAFIA TÉCNICA UTILIZADA PARA SEPARAÇÃO DE MISTURAS COMPLEXAS DE SUBSTÂNCIAS. Solvente fluindo continuamente a partir de um reservatório Amostra aplicada INICIALMENTE UTILIZADA PARA SEPARAÇÃO DE COMPOSTOS COLORIDOS (CROMO: COR E GRAFIA: PINTURA)     Eluição e separação do componente 1 Eluição e separação do componente 2

CROMATOGRAFIA O método baseia-se na migração diferencial das substâncias em um sistema cromatográfico, constituído pela mistura a ser separada, pela fase móvel e pela fase estacionária. 1. Mistura a ser separada (substâncias orgânicas com diferentes solubilidades, afinidades etc) Componentes de uma cromatografia 2. Fase estacionária: constituído por um sólido ou um líquido 3. Fase móvel: constituída por um ou mais solventes ou por gases.

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO – Camada Delgada (CCD) Características: Fase estacionária: sólido polar finamente dividido como sílica (SiO2 x H2O), alumina (Al2O3). Fase móvel: Solventes orgânicos ou mistura de solventes com polaridades variadas, dependendo do que se deseja separar. Normalmente utiliza-se solventes apolares. Princípio: As substâncias polares adsorvem-se na fase estacionária polar, ficando mais fortemente retidas. Ao se passar um solvente apolar, este carregará primeiramente as substâncias apolares (migrarão primeiro).

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO – Camada Delgada (CCD) Cromatografia analítica: para pequenas quantidades de material. Placa Topo da placa Solvente Início Final

CCD – Cromatografia em Camada Delgada

CCD – Cromatografia em Camada Delgada

CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) Princípio: Coluna contendo fase estacionária finamente dividida. Pode ser um sólido (cromatografia por adsorção) ou um líquido com alto ponto de ebulição empacotado. Material muito utilizado: octadecil sulfato – fase reversa. Como fase móvel podem ser utilizados tampões aquosos ou solventes orgânicos. Ocorre aplicação de uma alta pressão na entrada da coluna, fazendo com que o material seja separado muito rapidamente. Este sistema permite alta perfomance e reprodutibilidade (condições constantes e padronizadas).

CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) Injetor Bomba Coluna Reservatório Detector Detectores de Ultra violeta, luz visível e índice de refração.

Detecção e quantificação: CLAE, AFLAPREP®, KOBRA® Cell CLAE- mais sensível e mais rápida, só que o custo do equipamento é alto; Método (CLAE) utilizando coluna de imunoafinidade (AFLAPREP®) para clean-up das amostras e derivatização pós-coluna para AFB1 e AFB2 com célula eletroquímica KOBRA® Cell : - componente principal do AFLAPREP® é a coluna de imunoafinidade, contendo no gel uma suspensão de anticorpo monoclonal fixado em suporte sólido. O extrato da amostra é passado por esta coluna. Se alguma aflatoxina estiver contida na amostra irá ser retida pelo anticorpo suspenso no gel. A toxina ligada ao anticorpo é eluída da coluna com metanol ou acetonitrila. O eluato é analisado via CLAE.

Detecção: cromatografia de imunoafinidade (IAC)

Detecção e quantificação: CLAE, AFLAPREP®, KOBRA® Cell É necessário que se faça a derivatização das AFB1 e AFG1 a fim de realçar sua fluorescência sob a luz UV e fazê-las detectáveis mais facilmente. A KOBRA®Cell (R-BIOPHARM RHÔNE LTD, 2004) é uma célula eletroquímica que gera o agente de derivatização, bromo, do brometo de potássio presente na fase móvel. O anticorpo é específico para AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2 A derivatização das aflatoxinas ocorre rapidamente na temperatura ambiente

Detecção e quantificação: CLAE, AFLAPREP®, KOBRA® Cell Cromatograma de pool de padrões sem KOBRA® Cell Cromatograma de pool de padrões com KOBRA® Cell

Detecção: Imunoensaio ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) Baseia-se na interação entre antígeno (aflatoxina) e anticorpo. Para resultados mais precisos, com instrumentos de leitura como um espectrofotômetro ou uma leitora de microplacas por absorbância, pode-se obter até mesmo a concentração. Este já é chamado de ELISA QUANTITATIVO. Normalmente, para isto, deve-se possuir padrões, com valores de concentração conhecidos. A partir destes padrões, pode-se traçar uma curva de calibração. As amostras a serem testadas são colocadas sobre a superfície de poços plásticos, aos quais se ligam inespecificamente; locais de adesividade residual são bloqueados pela adição de proteínas irrelevantes. O anticorpo marcado é então acrescido aos reservatórios 38 sob condições nas quais se evita a ligação inespecífica, de modo que apenas o antígeno A retém o anticorpo na superfície. O anticorpo marcado não-ligado é removido dos reservatórios pela lavagem, enquanto o anticorpo ligado é detectado por uma reação de troca de coloração enzima-dependente (Figura 9). Este ensaio permite que séries de reservatórios, conhecidas como placas de microtitulação, sejam lidas em espectrofotômetros multicanais de fibras óticas, o que aumenta muito a rapidez do teste.