Calorimetria em estudos biofísicos Karin A. Riske

1ª lei  E univ = 0 2ª lei  S univ ≥ 0  E sis +  E viz = 0  S sis +  S viz ≥ 0  E sis +  E viz = condições de interesse biológico T, P constantes  V sis = –  V viz (q P sis – P  V sis ) + (q P viz – P  V viz ) = 0 q P viz = – q P sis = –  H sis  S sis +  S viz ≥ 0  H sis - T  S sis ≤ 0 G ≡ H - TS  G =  H - T  S  G sis ≤ 0 energia livre de Gibbs (q sis - w sis ) conceitos termodinâmicos

 G =  H – T  S  G < 0processo espontâneo  G > 0processo não espontâneo  G = 0equilíbrio termodinâmico energia útil para realizar trabalho calor absorvido (endo ) > 0 liberado (exo) < 0 contribuição entrópica balanço entre  H e T  S T, P constantes conceitos termodinâmicos

 G =  H – T  S < 0  H < 0  S > 0 sempre espontâneo  H > 0  S < 0 nunca espontâneo  H < 0  S < 0 T baixa  H > 0  S > 0 T alta

 H - entalpia rearranjo das ligações/interações químicas quebra de ligações: processo endotérmico (  H > 0) formação de ligações: processo exotérmico (  H < 0) Tipo de interaçãoEnergia de interação (kJ/mol) ligação covalente iônica ligação de hidrogênio20-40 íon-dipolo4-30 dipolar0,4-4 van der Waals4-30* * apenas significativa a distâncias muito pequenas entre átomos/moléculas, diminuindo abruptamente com a distância.

 S - entropia S = k lnW entropia de um sistema está ligada ao número de arranjos microscópicos (microestados) de um sistema macroscópico peptídeolipídio

exemplo 1: gelo → água  H > 0  S > 0  G > 0 para T < 0 o C  G = 0 para T = 0 o C  G 0 o C processo espontâneo?  H ?  S ?  G =  H – T  S ≤ 0

 H – interações  S – graus de liberdade interações feitas E-S interações desfeitas E-água S-água conformações E-S, água conformações E-água, S-água, água  G =  H – T  S ≤ 0 exemplo 2: enzima E + substrato S → complexo ES

Calorimetria diferencial de varredura (DSC) Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) Mede o calor específico de uma substância em função da temperatura: transições de fase Mede o calor liberado/absorvido decorrente da interação entre dois compostos (T constante)

Calorimetria diferencial de varredura (DSC) sólido líquido água gelo ordem desordem fase gel fase fluida  H > 0 absorção de calor estado nativoestado desnaturado estudo de transições de fase bicamadas lipídicas desnaturação de proteneínas

Calorimetria diferencial de varredura (DSC)

Amostra Referência  T = 0 T (K/s)  P (J/s) cela adiabática  Cp (J/K) velocidade de varredura

Hidrofílica: polar Hidrofóbica: apolar Bicamadas lipídicas lipídios e detergentes: moléculas anfifílicas auto-agregação devido ao efeito hidrofóbico (ganho entrópico de moléculas de água “bulk”) cmc (concentração micelar crítica) detergentes

Bicamadas lipídicas Lipossomo Vesícula Bicamadas lipídicas lipídios

gel fluid TmTm transição de fase de bicamadas

DMPC  S =  H / T m  G = 0 (T m )  H é a energia necessária para quebrar as ligações/interações existentes na fase ordenada

PC 18:0 16:0 14:0 transição de fase de bicamadas - comprimento da cadeia

cadeiaT m ( o C) 12:0 14:023 16:041 18:055 20:066 22: di18:0 18:0 / 18:1 di18:1 - comprimento da cadeia - grau de insaturação (duplas ligações) transição de fase de bicamadas

colesterol alargamento da transição - efeito do colesterol

DMPG transição de fase de bicamadas lipídio aniônico

[NaCl] transição de fase de bicamadas comportamento “normal” comportamento “peculiar”

Proteínas Estrutura de proteínas: primária: sequência de aa secundária: ligações H formando padrões repetidos terciária: arranjo 3D quaternária: arranjo 3D de mais de uma cadeia  -folha  -hélice

Desnaturação de proteínas estrutura funcional perda da função TmTm

Desnaturação de proteínas

Nativa Maior transição Intermediário Desnaturada Desnaturação de proteínas

CpCp TmTm HH Temperatura (°C) C p (kJ/mol/°C)  C p : reflete mudanças no estado de hidratação da proteína quando resíduos hidrofóbicos são expostos ao solvente

T m shift of chymotrypsinogen (1.8 mg/ml) with increasing pH. Desnaturação de proteínas pH aumento da estabilidade da proteína

DSC scans of Ribonuclease A with increasing concentrations of the inhibitor 2’CMP. Desnaturação de proteínas [inibidor] aumento da estabilidade da proteína

calorimetria de titulação isotérmica (ITC) estudo da afinidade/ligação entre substâncias composto A composto B cela de medidacela de referência

MedidaReferência  T = 0 dP (  cal/s) cela adiabática ITC reference power: 0-30  cal/s Temp constante

ITC

 H - medido  S = (  H –  G)/T K - modelo  G = – RTlnK

ITC exemplo 1: determinação da CMC de detergentes e  H mic CMC  H > 0  S > 0 efeito hidrofóbico clássico

ITC  H demic = kcal/mol CMC = 0.27 mM Triton X-100 tampão

ITC exemplo 2: partição de detergentes em bicamadas, K, e  H W-bilayer [Triton X-100] < cmc lipossomos

ITC insertion C f det exemplo 2: partição de detergentes em bicamadas, K, e  H W-bilayer C lip C b det K – constante de afinidade

ITC exemplo 2: partição de detergentes em bicamadas, K, e  H W-bilayer

ITC exemplo 3: interação peptídeo antimicrobiano-lipídio

ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio P + L PL K app = [PL] / [P][L]  G o = - RT ln K app K int = [PL] / [P] surf [L] [P] surf = [P]  e -e  o/kT  o – potencial de superfície muda à medida que o peptídeo se liga modelo de Gouy-Chapman + _ _____ ____

ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio lipossomos + peptídeos

b) ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio Gomesina Acanthoscurria gomesiana _ _____ ____ 1:1 POPC:POPG z = +6 anfipático

ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio ajuste com o modelo: K = 10 4 M -1  H = -7.8 kcal/mol peptídeo z p ~ 6 ~6 POPGs / Gm / +-  G = RT lnK ~  H (  S ~0) processo exotérmico

ITC exemplo 3: interação peptídeo-lipídio Análogos da gomesina (aa específicos silenciados para alterar o balanço hidrofílico-hidrofóbico) + hidrofóbicos interação mais forte + hidrofílicos interação mais fraca

Agradececimentos Tatiane Sudbrack Bruno Mattei Tatiana Domingues Katia R. Perez Antonio Miranda M. Teresa Lamy