ENZIMAS

Enzimas são polímeros biológicos que catalisam as reações químicas que tornam a vida possível como a conhecemos. A presença e a manutenção dum conjunto completo e balanceado de enzimas é essencial na digestão dos nutrientes para o fornecimento de energia e de estruturas bioquímicas. Essas estruturas serão depois sintetizadas em proteínas, DNA, membranas, células e tecidos.

A energia produzida será necessária para fornecer a potência para a mobilidade celular e contração muscular. Com a exceção de algumas moléculas catalíticas de RNA a grande maioria dos enzimas são constituídos por proteínas. As deficiências na quantidade ou na atividade catalítica dos enzimas chave resultam das deficiências genéticas, défices nutricionais ou toxinas. Os enzimas com defeitos podem ser resultado, também, de mutações genéticas, infeções virais ou genes patológicos de batérias.

ENZIMAS SÃO CATALISADORES ALTAMENTE ESPECÍFICOS Os enzimas que catalisam a conversão de um ou mais compostos (substratos) em um ou mais diferentes compostos (produtos), aumentam as velocidades de reação em 105 a 1017 vezes superior à velocidade da mesma reação não-catalisada. Como todos os catalisadores, os enzimas não são consumidos ou permanentemente alterados como consequência da sua participação na reação. Especificidade muitíssimo elevada, que tem a ver com a natureza do substrato e dos produtos finais da reação; o enzima “reconhece” o seu substrato e catalisa a sua reação de tal forma que raramente são formados produtos laterais (indesejados) da reação.

Os enzimas são as biomoléculas mais importantes em qualquer processo bioquímico. Catalisam centenas de passos reacionais que degradam as moléculas de nutrientes, conservam e transformam a energia química e produzem macromoléculas a partir de percursores simples. Na ação dos enzimas regulatórios, os percursos metabólicos são muito bem coordenados para realizarem uma convivência harmoniosa das muitas atividades necessárias para a sustentação da vida.

PROPRIEDADES DOS ENZIMAS Condições mais suaves de reação, ou seja, as condições em que reações catalisadas por enzimas são médias: temperaturas abaixo dos 100ºC, pressão atmosférica e pH próximo do fisiológico. Capacidade de regulação: a atividade catalítica de muitas enzimas varia de acordo com a concentração de substrato. Os mecanismos de regulação incluem controlo alostérico, modificação covalente de enzimas e variação da quantidade de enzima sintetizada.

A atividade catalítica depende da integridade da conformação da proteína nativa. Se um enzima for desnaturado ou dissociado nas suas subunidades a atividade catalítica é normalmente perdida. Se um enzima é dissociado nos seus aminoácidos, a sua atividade catalítica é sempre destruída. As estruturas primária, secundária, terciária e quaternária dos enzimas proteicos são essenciais para a sua atividade catalítica.

ENZIMAS FACILITAM O DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS Muitas doenças são há muito tempo conhecidas como resultado das alterações no DNA de cada indivíduo, as ferramentas para a deteção das mutações genéticas somente estão recentemente disponíveis mundialmente. Estas técnicas estão baseadas na eficiência e especificidade catalítica dos enzimas. Por exemplo, a reacção em cadeia da polimerase (PCR) baseia-se na habilidade dos enzimas servirem de amplificadores da análise de DNA presente nas amostras biológicas e forences.

ENZIMAS UTILIZADOS EM DIAGNÓSTICOS CLÍNICOS

COFATORES E COENZIMAS Os grupos funcionais das proteínas podem facilmente participar em reações ácido/base, formando certos tipos de ligações covalentes e tomam parte nas interações carga/carga. São assim piores para catalisar reações redox mas, apesar disso, os enzimas catalisam estas reações, graças à associação nestas de pequenas moléculas, cofatores, que agem como “dente químico” do enzima.

Um coezima ou metal iónico que está covalentemente ligado ao enzima é chamado grupo prostético. Um enzima completo, catalíticamente ativo, juntamente com o ser coezima/ ou ião metálico é chamado de holoenzima. A parte proteica é designada de apoenzima ou apoproteína. Os coezimas atuam como percursores transientes dos grupos funcionais específios. A maioria são derivados de vitaminas (nutrientes orgânicos necessários em pequenas quantidades na dieta humana).

CLASSIFICAÇÃO DOS ENZIMAS

COENZIMAS TÊM QUE SER REGENERADOS Os coenzimas são alterados quimicamente pela reação enzimática em que participam. Assim, para completar o ciclo catalítico, o coenzima tem de voltar ao seu estado inicial. Nos grupos prostéticos a regeneração ocorre numa fase separada da sequência da reação enzimática. Muitos organismos não são capazes de sintetizar certos coenzimas. Assim, essas substâncias têm de estar presentes na dieta do organismo. Certas vitaminas estão assim nesta lista de coenzimas e a sua carência pode provocar uma série de doenças provocadas por catálises enzimáticas incompletas.

MECANISMOS CATALÍTICOS Os enzimas, baixam a energia de ativação duma determinada reação. O que as torna tão eficientes é o fato de terem uma enorme especificidade de ligação ao substrato, combinada com o arranjo dos seus grupos catalíticos e com a combinação de vários mecanismos catalíticos. Existem assim seis grupos de catálises empregues pelos enzimas.

DIMINUIÇÃO DA ENERGIA DE ATIVAÇÃO

CATÁLISE ÁCIDO-BASE A catálise ácida é, geralmente, um processo no qual protões parciais se transferem de um ácido e vão baixar a energia de transição de uma reação. Muitas reações bioquímicas são suscetíveis a catálise ácido-base; as cadeias laterais de alguns resíduos proteicos possuem pK’s perto do pH fisiológico, que vai assim permitir que ajam como catalisadores ácidos ou básicos. Assim, a habilidade dos enzimas em arranjarem vários grupos catalíticos em volta do seu substrato, faz com que a catálise ácido-base seja um mecanismo de catálise enzimática bastante comum. Logo, vem que a atividade catalítica destas enzimas é sensível ao pH, já que o pH influencia o estado de protonação das cadeias laterais do centro ativo.

CATÁLISE COVALENTE A catálise covalente acelera a reação através da formação de uma ligação covalente catalisador-substrato. Normalmente esta ligação covalente é formada pela reação de um grupo nucleófilo catalisador com um eletrófilo no substrato. A catálise covalente pode ser decomposta em três partes: 1. A reação nucleófila entre o catalisador e o substrato para formar uma ligação covalente; 2. A troca de eletrões do centro da reação com o agora eletrofílico catalisador; 3. A eliminação do catalisador, uma reação que é essencialmente a inversa de 1.

CATÁLISE METAL-IÓNICA Perto de um terço de todos os enzimas conhecidos necessitam da presença de iões metálicos para a atividade catalítica. Este grupo de enzimas inclui as metaloenzimas que contêm como cofatores iões metálicos (como o próprio nome indica). Os enzimas metal-ativados, em contraste, ligam metais iónicos de soluções, normalmente metais alcalinos ou alcalino-terrosos.

Os iões metálicos participam no processo catalítico de três formas principais: 1. Ligando-se aos substratos, de maneira a orientá-los adequadamente para a reação; 2. Permitindo reações redox, através de mudanças reversíveis nos seus estados de oxidação; 3. Através de estabilização eletrostática ou “blindando” cargas negativas.

CATÁLISE ELETROSTÁTICA A ligação de um substrato geralmente exclui a água do centro ativo dum enzima. Assim, pode dizer-se que o centro ativo tem as caraterísticas polares dum solvente orgânico, onde as interações eletrostáticas são muito mais fortes que numa solução aquosa. As distribuições de carga à volta do centro ativo de um enzima estão arranjadas de maneira a estabilizar os estados de transição das reações catalisadas. Por outro lado, em muitos enzimas as distribuições das cargas vão, aparentemente, guiar substratos polares aos sítios da ligação, aumentando assim a velocidade da reação.

CATÁLISE ATRAVÉS DE PROXIMIDADE E EFEITOS DE ORIENTAÇÃO Os efeitos mais óbvios são proximidade e orientação: os reagentes têm de se “unir” ao enzima com a relação espacial própria, de forma a poder dar-se a reação. Assim, por simplesmente ligarem os seus substratos, os enzimas facilitam a reação em três aspetos: 1. Os enzimas levam os substratos ao contato com os seus grupos catalíticos; 2. Os enzimas ligam os seus substratos na orientação adequada para a reação; 3. Os enzimas param as deslocações de translação e rotação dos substratos e grupos catalíticos. Este aspeto é importante pois favorece o aparecimento do estado de transição, onde os movimentos relativos aos compostos são mínimos.

CATÁLISE POR PREFERÊNCIA DE LIGAÇÃO E DE ESTADO DE TRANSIÇÃO Um enzima pode ligar o estado de transição da reação que catalisa com maior afinidade que os substratos ou produtos. Assim, os enzimas que se ligam preferencialmente ao estado de transição aumentam a concentração deste, aumentando assim proporcionalmente a velocidade da reação. Por este fato, os estados de transição análogos são inibidores da reação, uma vez que o enzima os “agarra” como se fossem a molécula a catalisar, inativando-a. Acontece por vezes que estes análogos tenham maior afinidade com o enzima do que a molécula que pretendemos catalisar.

MECANISNO DA HEXOCINASE

CINÉTICA ENZIMÁTICA Geralmente, a velocidade de catálise (V) varia com a concentração do substrato [S]. De tal forma que, para uma concentração fixa de enzima, V é quase linearmente proporcional a [S], quando [S] é pequena. Por outro lado, quando a concentração [S] tem valores elevados, velocidade de catálise é praticamente independente de [S]. O modelo proposto por Michaelis-Menten explica as propriedades cinéticas dos enzimas.

Progressão das curvas para uma reação simples catalisada por um enzima Progressão das curvas para uma reação simples catalisada por um enzima. Com exceção da fase inicial da reação, os declives das curvas de [E] e [ES] são essencialmente zero enquanto [S] >>[E].

Um enzima, E, combina-se com o substrato, S, para formar o complexo ES, com uma constante de velocidade K1. O complexo ES pode dissociar-se em E e S, com uma constante de velocidade K2, ou pode prosseguir para formar o produto, P, com uma constante de dissociação K3. A equação que explica as propriedades cinéticas das enzimas é a equação de Michaelis-Menten. sendo Km=(K2+K1)/K3 a constante de Michaelis. Quando a concentração de substrato S é igual ao valor de Km, a velocidade de reação é metade da sua velocidade máxima; isto é, V=½ Vmáx.

Quando a concentração de substrato S é igual ao valor de Km, a velocidade de reação é metade da sua velocidade máxima; isto é, V=½Vmáx. O gráfico de V0 (velocidade inicial) de uma reação enzimática simples vs [S]

CÁLCULO DE Vmax E Km Os valores de Vmáx e Km podem ser determinados fazendo variar a concentração de [S] a partir da linearização de Lineweaver-Burk, a qual transforma a equação de Michaelis-Menten num gráfico em linha reta de 1/V em função de 1/[S] , o qual interseta o eixo de 1/V no ponto 1/Vmáx com uma inclinação de Km/Vmáx.

“TURNOVER NUMBER” É equivalente ao número de moléculas de substrato convertido em produto num certo perídodo de tempo numa molécula de enzima quando este encontra-se saturado com substrato. A melhor maneira para comparar as eficiências catalíticas de enzimas diferentes ou o “turnover” de substratos diferentes pelo mesmo enzima é a comparação do racio kcat/Km para duas reações. Este parâmetro, é às vezes chamado de constante específica, é a constante de velocidade para a conversão de [E] +[ S] para [E] +[ P]. Quando [S] <<Km: V0 depende da concentração dos dois reagentes, [Et] e [S].

ENZIMAS CATALISAM REAÇÕES COM DOIS OU VÁRIOS SUBSTRATOS Reações enzimáticas com dois substratos normalmente envolvem a transferência de um átomo ou um grupo funcional de um substrato para outro. Estas reações procedem num ou diferentes passos. Nalguns casos, os dois substratos estão ligados ao enzima formando um complexo terciário não covalente. Mecanismo Ping-Pong

INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Os inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem com a catálise, alterando ou tornado as reações enzimáticas mais lentas. Os enzimas catalisam praticamente todos os processos celulares. Não é de surpreender que os inibidores enzimáticos são os agentes farmacológicos mais importantes. Por exemplo, a aspirina (ácido acetilsalicílico) inibe o enzima que catalisa o primeiro passo da síntese de prostaglandis, compostos que estão involvidos em muitos processos, incluindo alguns que provocam a dor.

Os enzimas podem sofrer dois tipos de inibição: 1.Inibição irreversível, na qual o inibidor se dissocia muito lentamente do “enzima-alvo”; 2. Inibição reversível, que é caraterizada por uma dissociação rápida do complexo enzima-inibidor.

INIBIÇÃO COMPETITIVA O enzima pode ligar-se ao substrato (formando um complexo ES) ou ao inibidor (formando o complexo EI), porém nunca se pode ligar aos dois (ESI). Um inibidor competitivo é semelhante ao substrato, ligando-se ao centro ativo do enzima, impedindo assim que o substrato se ligue ao centro ativo do enzima. Portanto, este tipo de inibidor diminui a velocidade de catálise, reduzindo a proporção de moléculas de enzima ligados a um substrato.

INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA O substrato e o inibidor podem ligar-se ao enzima em simultâneo. Então, um inibidor não competitivo age pela diminuição do número de renovação, em detrimento da diminuição da quantidade de complexos ES.

INIBIÇÃO MISTA Um inibidor tanto afeta a ligação do substrato, quanto altera o número de renovação.

INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Os inibidores irreversíveis são aqueles que ligam-se covalentemente ou destroem o grupo funcional (essencial para a atividade catalítica) dum enzima, ou aqueles que formam uma associação não covalente particularmente estável sendo este processo é muito comum. Os inibidores irreversíveis são ferramentas muito úteis para o estudo de mecanismos reacionais dos enzimas. Aminoácidos com funções catalíticas chave no centro ativo podem ser identificados para a determinação do resíduo que está covalentemente ligado ao inibidor após o enzima se encontrar desativado.

INFLUÊNCA DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA A atividade catalítica aumenta, à medida que o pH aumenta. No entanto, ao atingir um determinado valor de pH, a atividade catalítica atinge o seu máximo - pH óptimo. A partir deste valor de pH, a atividade catalítica dos enzimas começa a diminuir, dado que valores pH muito elevados originam a desnaturação das proteínas. Gráficos da influência do pH na atividade enzimática

INFLUÊNCA DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA À medida que a temperatura aumenta, a atividade catalítica aumenta também, até atingir um determinado valor - Temperatura Óptima. A partir desta temperatura, que corresponde ao valor máximo de atividade enzimática, a atividade catalítica começa a diminuir, pois, a temperaturas elevadas inicia-se a desnaturação térmica das proteínas. Gráfico da influência da Temperatura na atividade enzimática

REGULAÇÃO DAS ATIVIDADES Apesar da existência de oscilações de curto prazo nas concentrações dos metabolitos e níveis de enzimas, as células vivas permanecem num estado dinâmico onde as concentrações médias dos intermediários metabólicos permanecem relativamente constantes ao longo do tempo.