Prof. Dr. Caio M. M. de Cordova, FURB Padronização e implantação do diagnóstico laboratorial da Tuberculose em amostras biológicas e da detecção de cepas resistentes às drogas utilizadas no tratamento por métodos de biologia molecular Prof. Dr. Caio M. M. de Cordova, FURB

Metodologia Aplicada Pacientes: indivíduos em diagnóstico com suspeita de tuberculose ou em acompanhamento de tratamento. Amostras: escarro, coletado pela manhã, no Lab. Municipal de Blumenau. Tratamento das amostras: NaOH 1 % , SDS 3 %, H3PO4 PCR para Mycobacterium tuberculosis: para digestão com proteinase K e extração com fenol/clorofórmio. Amplificação do DNA com um par de oligos específicos para as cepas do complexo M. tuberculosis, resultando num produto amplificado de 123 pb do elemento de inserção IS6110. Baciloscopia: em esfregaços da amostra tratada, após a coloração de Ziehl-Neelsen. Cultura de Mycobacterium spp.: A cultura das amostras tratadas será feita em meio de Lowenstein-Jensen, com incubação a 37 OC por 8 semanas. Identificação de espécies de Mycobacterium sp.: PCR-RFLP amplificando fragmento e 294 bp do gene hsp65 e digerido com as enzimas CfoI e Sau96I .

Metodologia Aplicada Padronização dos métodos moleculares para análise das mutações em M. tuberculosis que causam resistência às drogas : A metodologia utilizada para detectar as mutações foi a de PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polimorphism PCR): Rifampicina: Para detecção das cepas resistentes a rifampcina, foi amplificada uma região central do gene rpoB, onde são encontradas mutações pontuais, ou pequenas deleções ou inserções responsáveis por 96% dos casos de resistência à esta droga. Isoniazida: Para detecção das cepas resistentes à isoniazida, foram analisadas mutações no gene katG, responsável por 58 a 68% dos casos de resistência à esta droga, senão mais. Foram também analisadas mutações no gene inhA, que pode ser responsável por até 31,6% dos casos de resistência em certas populações.

Metodologia Aplicada Streptomicina: Para detecção das cepas resistentes à streptomicina, foram analisadas mutações no gene aphC, responsáveis por cerca de 65% a 75% dos casos de cepas resistentes a esta droga. Pirazinamida: Para detecção das cepas resistentes à pirazinamida, serão analisadas mutações no gene da pirazinamidase (pncA), responsável por cerca de 72% dos casos de cepas resistentes a esta droga . Etambutol: Para detecção das cepas resistentes ao etambutol, serão analisadas mutações no gene embB, responsável por cerca de 47% a 69% dos casos de cepas resistentes a esta droga. Quinolonas: nos casos de resistências às drogas de escolha, as quinolonas também podem ser usadas no tratamento, cuja resistência é dada principalmente por mutações no gene gyrA.

Resultados e Comentários Pacientes: estudo cego. Analisando as amostras de escarro dos pacientes obtidas no Laboratório Municipal de Análises Clínicas de Blumenau para pesquisa de M. tuberculosis, por baciloscopia após a coloração de Ziehl-Neelsen, 2,56 % (3/117 amostras) apresentaram resultado positivo.

Após amplificação do DNA dessas amostras através da PCR, utilizando primers específicos para M. tuberculosis, 2,56 % (3 em 117 amostras) tiveram resultado positivo, observado pela presença da banda de 123 pares de bases no gel de agarose a 2%. Eletroforese em gel de agarose a 2%, de produtos de PCR amplificados de amostras clínicas (linhas 3, 4 e 5) com um par de primers específicos para o complexo M. tuberculosis. Linha 1: controle positivo, 2: controle negativo, 6: 100 bp DNA Ladder (Invitrogen).

Cultura: incubando essas amostras em meio de Lowenstein-Jensen, a 37 OC, por aproximadamente três semanas, 7,69 % (9 em 117 amostras, P= 0,1384 ) apresentaram crescimento positivo para Mycobacterium sp.

Identificação de espécies de Mycobacterium sp. por PCR-RFLP: Das seis (06) amostras positivas somente por cultura, uma (01) foi possível identificar como pertencente ao complexo M. tuberculosis por PCR-RFLP, e outra (01) foi possível identificar como pertencente ao grupo que compreende as espécies M. fortuitum, M. smegmatis, M. nonchromogenicum, M. phlei, M. fallax, M. perigenicum, M. brumae (figura 3).

Amplificação do gene rpoB (349 bp):

Amplificação do gene gyrA (320 bp):

Amplificação do gene inhA (457 bp):

Amplificação do gene katG (703 bp):

Amplificação do gene pncA (940 bp):

Amplificação do gene ahpC (587 bp):

Amplificação do gene embB (399 bp):

SSCP do gene rpoB: 1 2 3 4 5 6 Eletroforese em gel de poliacrilamida a 11% de produtos de PCR do gene rpoB amplificados com os oligonucleotídeos rpoB-F e rpoB-R da cepa ATCC 25177 de Mycobacterium tuberculosis (2) e de amostras clínicas (3-6), onde se observa dois fragmentos de DNA correspondentes à migração de cada fita simples de DNA amplificado; (1): 100 bd DNA Ladder (Invitrogen).

Impactos do Projeto O oferecimento de novas tecnologias no diagnóstico da tuberculose propicia um grande avanço para a população, que passa a ter acesso aos serviços mais modernos no controle desta doença. Propicia ainda dados mais precisos para o levantamento epidemiológico e elaboração das políticas públicas de saúde.

Aplicabilidade para o SUS A implantação sistemática da tecnologia disponível depende de acertos com o gestores do sistema de saúde. Os métodos moleculares, padronizados no próprio laboratório, tem um custo unitário por teste menor que os métodos tradicionais de cultura. Além deste custo direto, o início precoce do tratamento adequado, bem como o monitoramento da resistência bacteriana, tem grandes impactos na otimização do uso dos medicamentos, e na redução da necessidade de serviços de maior complexidade pelo tratamento correto iniciado sem demoras.

Data/Local da Publicação Publicações Data/Local da Publicação Título Brazilian Journal of Microbiology, in press Sociedade Brasileira de Microbiologia, São Paulo, Brasil, 2008 Evaluation of methods for detection and identification of Mycobacterium species in patients suspected of pulmonary tuberculosis 5º Fórum Anual de Iniciação Científica da FURB 2006, Blumenau, FURB. Aplicação da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) no diagnóstico laboratorial da tuberculose IV Seminário de Grupos de Pesquisa e II Seminário de Iniciação Científica da ACAFE 2006, Criciúma. Aplicação da reação em cadeia da polimerase (PCR) no diagnóstico laboratorial da tuberculose Trabalhos de conclusão de curso de graduação - Jose Antonio Martins da Silva 2007. Curso (Farmácia) - Fundação Universidade Regional de Blumenau Identificação e detecção de cepas resistentes às drogas utilizadas no tratamento da tuberculose, por métodos de biologia molecular, e seu diagnóstico laboratorial em amostras biológicas de pacientes da região de Blumenau Trabalhos de conclusão de curso de graduação - Adrian Manuel Marchi 2006. Curso (Farmácia) - Fundação Universidade Regional de Blumenau IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM AVIUM EM PACIENTES COM SUSPEITA DE TUBERCULOSE PULMONAR POR MÉTODO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Trabalhos de conclusão de curso de graduação - Thays Silva de Andrade 2005. Curso (Farmácia) - Fundação Universidade Regional de Blumenau AVALIAÇÃO DA REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) NA TRIAGEM DE PACIENTES COM SUSPEITA DE TUBERCULOSE Iniciação científica - Adrian Manuel Marchi. 2006. Iniciação científica (Farmácia) - Fundação Universidade Regional de Blumenau Padronização e implantação da detecção de cepas de M. tuberculosis resistentes às drogas utilizadas no tratamento por métodos de biologia molecular, no Laboratório de Análises Clínicas do Ambulatório da Universidade Regional de Blumenau

Agradecimentos FAPESC Fundação Universidade Regional de Blumenau