Métodos de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA) Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado Diretora Técnica Instituto Paulista de Doenças Infecciosas e Parasitárias Laboratórios Laboratório Central - HSP - UNIFESP Métodos de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA)

sair

Beta Lactâmicos sair GRUPOS: Penicilina Cefalosporinas Monobactâmicos: aztreonam Carbapenêmicos: imipenem meropenem ertapenem Anel -lactâmico O Sítio de ação da -lactamase

Cefalosporinas sair 3a Geração 1a Geração 2a Geração 4a Geração Cefazolin Cefoperazona Cefotaxima Ceftazidima Ceftizoxima Ceftriaxona 2a Geração Cefamandol Cefonicid Cefotetan Cefoxitina Cefuroxima 4a Geração Cefepima

RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS sair Aeróbios Metronidazol Natural ou intrínseca ou Constitutiva Anaeróbios Aminoglicosídeos Adquirida Mutação de genes Cromossômica Resistência única-não é transmitida de célula para célula a menos que o gene esteja em integron Produção: ß-lactamases, fosfotransferases, hidrolases, redutases. Plasmidial Transmissível Resistência múltipla

Evolução Clínica sair Paciente Antimicrobiano Microrganismo Imunidade Farmacologia Microrganismo Antimicrobiano Teste de sensibilidade

Reprodução da descoberta de Fleming sair Reprodução da descoberta de Fleming Reprodução da placa de Fleming para a prova de sensibilidade aos antibióticos

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS sair METODOLOGIAS Avaliação QUALITATIVA DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Avaliação QUANTITATIVA DILUIÇÃO EM CALDO Macrodiluição Microdiluição DILUIÇÃO EM ÁGAR AUTOMATIZADOS ETEST

Método quantitativo  MIC MACRODILUIÇÃO sair Método quantitativo  MIC g/mL 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 .8 .4 controle Conceito Precisão Vantagens Desvantagens

MACRODILUIÇÃO EM CALDO sair

Determinação do MIC MIC sair g/mL 12.5 6.25 3.12 MIC É a menor concentração inibitória mínima que inibe completamente o crescimento bacteriano.

MACRODILUIÇÃO MIC MBC sair • • • • • • • • • • • • g/mL 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 . 8 .4 controle • • • • • • • • • • • • MBC

MICRODILUIÇÃO sair

TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair Utilizado rotineiramente Fácil execução Flexibilidade na escolha dos antibióticos Reprodutibilidade nos resultados Padronização dos resultados Baixo custo

TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair Princípio do método

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Leitura e Interpretação sair Leitura e Interpretação mm

DILUIÇÃO EM ÁGAR sair Utilizado em estudos epidemiológicos Fácil execução Permite testar vários isolados simultaneamente Promove resultados quantitativos Permite o teste de bactérias fastidiosas Baixo custo (relativo) Poucos isolados Preparo das placas e estocagem

DILUIÇÃO EM ÁGAR sair Enterococcus spp. Ágar com 6 g/mL de Vancomicina Enterococcus spp. S   4 g/mL I  8-16 g/mL R   32 g/mL

Diluição em Ágar - Desvantagens sair Muito trabalhoso, tanto a preparação das placas quanto a preparação do inóculo, especialmente quando vários antimicrobianos devem ser testados As placas de ágar não podem ser armazenadas por muito tempo Helio Sader - LEMC

Etest sair Princípio do método

Etest®Difusão sair

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos sair Curva de regressão

Relação entre o MIC, Zona de inibição e “Breakpoints”. sair

MIC  DIFUSÃO sair g/mL 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 . 8 .4 controle 30 50 25 12.5 6.25 3.12 18 mm

Interpretação do Etest sair

Interpretação do Etest sair

Interpretação do Etest sair

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS CLSI - antigo“NCCLS” sair Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilização de normas e procedimentos laboratoriais padronizados. A subcomissão do CLSI é composta de representantes de profissões, do governo e indústria, incluindo laboratórios de microbiologia, educadores, farmacêuticos, etc.

TESTE DE SENSISIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS sair Padronização Processos Padronizados (POPs) Controle de qualidade dos itens: meios (efeito timidina ou timina) pH temperatura incubação discos (ATCCs) fitas de Etest

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Bactéria e Preparo do Inóculo Suspensão direta Método de crescimento 0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Bactéria e Inóculo Bactéria recentemente isolada Colônias bem isoladas

CRESCIMENTO BACTERIANO sair

TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair MEIOS 1- Ágar Mueller-Hinton 2- Ágar Mueller-Hinton suplementado 3- Ágar GC 3- Haemophilus Test Medium (HTM)

TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair MEIO MUELLER- HINTON Reprodutibilidade do teste. Baixo teor de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas. Permite crescimento satisfatório da maioria dos patógenos. Grande número de dados e experiência com o meio.

TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR O que devemos saber sobre os meios? sair O que devemos saber sobre os meios? Hidratar e autoclavar 60 a 70 mL 150 mm 25 a 30 mL 90 mm pH 7.2 a 7.4 Conservação 2 a 8oC Teste de esterilidade 4 mm

TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair O que devemos saber sobre os meios? Umidade Efeito da Timidina ou Timina Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim. Conservação 2 a 8oC Teste de esterilidade Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio

TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair Discos Conservação 8oC ou  freezer (não “frost free”) Imipenem, Ertapenem Cefaclor e combinações de ác.clavulânico Retirar do refrigerador ou do freezer até 2 horas antes do uso Evitar umidade Data de validade

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Seleção dos antibióticos sair Seleção dos antibióticos Laboratório Clínico Infectologistas Comissão de Infecção Hospitalar Comissão de Controle de Antimicrobianos Farmácia

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos sair Quando e porquê realizar o antibiograma? Isolado requer terapia antimicrobiana Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva Isolado capaz de exibir resistência Orientação terapêutica Permite individualizar padrões de resistência

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inóculo Métodos: Crescimento Suspensão direta

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inóculo - Método do crescimento 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB Incubar a 35oC - (2 a 6h) Ajustar a turbidez 0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Inóculo - Suspensão direta Procedimento sair Inóculo - Suspensão direta 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB ou salina Ajustar a turbidez 0,5 McFarland 1 a 2 x 108 UFC/mL Estabilizar 15 min.

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inóculo

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inoculação

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inoculação Superfície do ágar não deve estar úmida Inoculação homogênea Esperar diminuir a umidade antes da aplicação dos discos

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Aplicação dos discos Bateria pré determinada Aplicar e pressionar o disco Aplicar no máximo 12 discos na placa de 150mm 5 discos na placa de 90mm Inverter a placa e incubar 15 minutos após a aplicação

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Incubação Temperatura 35oC Atmosfera atm ambiente exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e estreptococos CO2

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Leitura e Interpretação sair Leitura e Interpretação

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS O que testar? Como interpretar?

sair “CLSI-2005 ” Quais são os antibióticos devemos utilizar? A lista de cada microrganismo compreende agentes de eficácia comprovada e que tem um comportamento aceitável nas provas in vitro. Quais são os antibióticos devemos utilizar? Grupo A: 1ª escolha - testados e reportados Grupo B: 1ª escolha - testados e reportados seletivamente Grupo C: suplementares e reportados seletivamente Grupo U: testados em isolados de urina Grupo O: outros não rotineiramente utilizados Grupo inv: em investigação

“CLSI” sair Recomendações na escolha dos antimicrobianos Padronização das técnicas Critérios para a interpretação dos resultados Parâmetros para o controle qualidade do teste.

Interpretação do Resultado sair Susceptível (S) A categoria susceptível implica que a infecção causada pela cepa bacteriana isolada pode ser adequadamente tratada com a dosagem do antimicrobiano recomendada para o tipo de infecção e o agente infeccioso. Desde que não haja contra indicação.

Interpretação do Resultado sair Intermediária (I) A categoria intermediária inclui isolados cujos MICs são próximos aos do sangue e tecidos. Ela permite a aplicabilidade do antimicrobiano em infecções em sítios onde as drogas são fisiologicamente concentradas ou quando doses maiores podem ser utilizadas.

Interpretação do Resultado sair Resistente (R) A categoria resistente inclui isolados que não são inibidos pelas concentrações usuais do antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha quando um específico mecanismo de resistência é expressado.

Avaliação da Sensibilidade Streptococcus pneumoniae sair Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro Inóculo  suspensão direta, 0,5 McFarland Incubação  35oC ± 2o em atm. 5% CO2 Leitura  20 a 24h Controle de qualidade  S.pneumoniae ATTC* 49619 CLSI, M100-S15, 2005

Avaliação da Sensibilidade Streptococcus pneumoniae sair Escolha dos discos  Tabela 2G Oxacilina  Penicilina não recomendado para outros estreptococos Diâmetros de inibição específicos (Tabela 2G) Interpretação Oxacilina  20 mm  Sensível  19 mm penicilina, meropenem e ceftriaxona ou cefotaxima MIC CLSI, M100-S15, 2005

Streptococcus pneumoniae sair Azitromicina Claritromicina CLORANFENICOL 3 ERITROMICINA 1 OFLOXACINA OXACILINA 1g  PENICILINA 1 RIFAMPICINA 3 GATIFLOXACINA 3 SULFA/TRIMET 1 VANCOMICINA 2 Ampicilina, Amoxacilina, amoxacilina/ác.clav. ampicilina/sulb., cefaclor, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona, cefuroxima, imipenem e meropenem  20mm S Levofloxacina Moxifloxacina < 17 mm Penicilina Meropenem Ceftriaxona MIC 19 mm CLSI, M100-S15, 2005

Avaliação da Sensibilidade Streptococcus spp. sair Mueller-Hinton agar com 5% de sangue de carneiro Inóculo  suspensão direta Incubação  35oC ± 2o em atm. 5% CO2 Leitura  20 a 24h Controle de qualidade  S.pneumoniae ATTC* 49619 CLSI, M100-S15, 2005

Avaliação da Sensibilidade - Enterococos sair Ágar Mueller-Hinton Inóculo  crescimento ou suspensão direta Incubação  35oC ± 2o em atm. ambiente Leitura  16 a 18h, 24h para Vancomicina  R MIC CLSI, M100-S15, 2005

Enterococcus resistente à Vancomicina (VRE) sair 1º Isolado final dos anos 80 30 anos após Vancomicina > 20% das infecções pelo Enterococo

Enterococcus resistente à Vancomicina (VRE) sair Resistência Intrínseca Enterococcus gallinarum e E. casseliflavus Resistência adquirida Enterococcus faecium e E. faecalis

Detecção do pigmento - Enterococcus spp. sair BHIA E. faecium E. faecalis E. gallinarum E. mundii Pigmento amarelo Sim Motilidade 30ºC Negativo Positivo E. casseliflavus

Avaliação da sensibilidade dos Enterococcus spp. sair S Imipenem E. faecalis AMPICILINA 1 CIPROFLOXACINA U CLORANFENICOL 3 GENTAMICINA 120 g 3 STREPTOMICINA 300 g 3 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 QUINUPRISTIN/DALFOPRISTIN 2 Penicilina S Amoxicilina, Amoxacilina/ác.clav., ampicilina/sulbactan, piperacilina e piperacilina/tazobactan. Para cepas não produtoras de  lactamases 24 h de incubação 15-16 mm  MIC Sinergismo positivo Sinergismo negativo Detecção de  lactamases + 7-9 mm  MIC R Penicilina E. faecalis ATTC® 29212 CLSI.M100 -S15, 2005

VRE sair + –

Avaliação da Sensibilidade Estafilococos sair Ágar Mueller-Hinton Inóculo  suspensão direta Incubação  33 a 35oC em atm. ambiente Leitura  16 a 18 24h  Oxacilina/Cefoxitina e Vancomicina MRSA e MRS CLSI, S15, 2005

Staphylococcus aureus Staphylococcus não aureus Staphylococcus aureus sair CIPROFLOXACINA 3 CLINDAMICINA 2 ERITROMICINA 2 GENTAMICINA 3 OXACILINA 1g 1 CEFOXITINA PENICILINA 1 SULFA/TRIMET 2 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 Quinupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA 3 Levofloxacina Ofloxacina CIPROFLOXACINA 3 CLINDAMICINA 2 ERITROMICINA 2 GENTAMICINA 3 OXACILINA 1g 1 CEFOXITINA PENICILINA 1 SULFA/TRIMET 2 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 Quinupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA 3 Azitromicina Claritromicina Rotineiramente não são reportado em urina <14mm  MIC MRSA MRS Gene mec A As penicilinas, cefens e outros  lactâmicos como amoxi/ác.clav., ampi/sulb., ticarcilina/ác.clav. e carbapenems Oxa s e PS  S Oxa R  PR Oxa s e PR   lactamase CLSI, S15, 2005

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL sair LABORATORY STANDARDS “NCCLS”- 2001 sair Staphylococcus spp. Vancomicina halo  14 mm MIC Incubação por 24horas a 33 a 35°C MIC  4 g Encaminhar a Laboratório de Referência

Detecção do VISA e VRSA sair Diluição em ágar BHIA 6 g/mL Vancomicina

Detecção do VISA e VRSA sair E-test

Avaliação da Sensibilidade Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp Avaliação da Sensibilidade Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia e Burkholderia cepacia sair Ágar Mueller-Hinton Inóculo  método do crescimento ou suspensão direta Incubação  35oC ± 2o em atm. ambiente Leitura  16 a 18h Controle de qualidade  P. aeruginosa ATTC* 27853  E. coli ATTC* 35218  E. coli ATTC* 25922 S. maltophilia e B. cepacia  20 a 24 horas P. aeruginosa na Fibrose cística CLSI.M100 -S15, 2005

Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp. sair AMICACINA 2 TOBRAMICINA 2 GENTAMICINA 1 CEFEPIMA 2 CEFTAZIDIMA 1 CIPROFLOXACINA 2 IMIPENEM 2 MEROPENEM 2 PIPERACILINA 1 TICARCICINA 1 PIPE/Tazo O TICARC/ Ác.clav. O POLIMIXINA AMICACINA 2 GENTAMICINA 1 AMPICILINA/Subac. CEFEPIMA 2 CEFTAZIDIMA 1 CEFTRIAXONA 3 CIPROFLOXACINA 2 IMIPENEM 2 MEROPENEM 2 PIPERACILINA 1 TICARCICINA 1 PIPE/Tazo O TICARC/ Ác.clav. O POLIMIXINA Cefotaxima Levofloxacina Pode ser reportado quando a cepa for resistente CLSI,M100 -S15, 2005

Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia cepacia sair LEVOFLOXACINA 2 MINOCICLINA 0 TRIMETOPRIM - SULFAMETOXAZOL 3 CEFTAZIDIMA 1 MEROPENEM 2 MINOCICLINA 0 TRIMETOPRIM - SULFAMETOXAZOL 3 CLSI.M100 -S15, 2005

Avaliação da Sensibilidade Enterobactérias sair Ágar Mueller-Hinton Inóculo  método de crescimento e suspensão direta Incubação  35oC ± 2o em atm. ambiente Leitura  16 a 18h Controle de qualidade  E. coli ATTC* 25922  E. coli ATTC* 35218 NCCLS.M100 -S15, 2005

Enterobactérias sair Amoxacilina Amoxacilina/ác.clavulânico Cefotaxima AMICACINA 2 AMPICILINA 1 AMPICILINA/Sulbactan 2 AZTREONAM 3 CEFALOTINA 1 CEFEPIMA 2 CEFTAZIDIME 3 CEFOXITINA 2 CEFTRIAXONA 2 CIPROFLOXACINA 2 GENTAMICINA 1 IMIPENEM 2 ERTAPENEM 2 PIPERACILINA/Tazobactan 2 SULFA/TRIMET 2 TICARCILINA/Äc.clavulânico2 Amoxacilina Amoxacilina/ác.clavulânico Cefotaxima Levofloxacina Meropenem CLSI.M100 -S15, 2005

Avaliação da Sensibilidade Haemophilus spp sair Ágar Haemophilus Test Medium (HTM) Inóculo  suspensão direta Incubação  35oC em atm. 5% CO2 Leitura  16 a 18h Controle de qualidade  H. influenzae ATTC* 49247  H. influenzae ATTC* 49766  E. coli ATTC* 39218 NCCLS.M100 -S15, 2005

Avaliação da Sensibilidade Haemophilus spp sair Ágar Haemophilus Test Medium Inóculo  suspensão direta Incubação  35oC em atm. 5% CO2 Leitura  16 a 18 + – O teste Positivo é preditivo de resistência à penicilina, ampicilina e amoxacilina

Neisseria gonorrhoeae sair Suspeita de falência terapêutica Vigilância Estudos para orientar terapia empírica NCCLS.M100 -S15, 2005

“RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” sair CEFOXITINA C. freundii Enterobacter spp Serratia spp Amp/A.clavulânico e Amp/sulbactam Citrobacter spp Enterobacter spp Serratia spp Man Clin Microb, 7ªedição, 1999

“RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” sair Enterobacteriaceae Citrobacter freundii Enterobacter spp M. morgani P. vulgaris P. penneri Providencia spp Serratia spp Yersinia enterocolitica CEFALOTINA Man Clin Microb, 7ªedição, 1999

“RESISTÊNCIA INTRÍNSECA” sair Enterobacteriaceae Citrobacter freundii Enterobacter spp Klebsiella spp M. morgani P. vulgaris P. penneri Providencia spp Serratia spp Yersinia spp AMPICILINA Man Clin Microb, 7ªedição, 1999

Perfis encontrados nos testes de sensibilidade que requerem nova avaliação da amostra. sair Microrganismos Perfil de sensibilidade a ser investigado Enterobacteriacea Resistência a carbapenems E. coli e K. pneumoniae Resistência às cefalosporinas de 3ª geração ou monobactans P.aeruginosa e A.baumannii Resistência à polimixina S. maltophillia Sensibilidade aos carbapenems e/ou resistência ao sulfam/trimetoprim N. meningitidis Resistência à penicilina N. gonorrhoeae Resistência à ceftriaxona Man Clin Microb, 7ªedição, 1999

Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos sair A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos representa uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia. O constante aparecimento de novos mecanismos bacterianos de resistência e novos antimicrobianos tornam os testes cada vez mais complexos É necessário uma atualização constante dos protocolos e a freqüente implementação de novos testes e metodologias. Microbiologistas, patologistas clínicos e médicos assistentes são obrigados a estarem em constante atualização

Antonia Maria de Oliveira Machado Muito obrigada! sair Antonia Maria de Oliveira Machado amachado-labc@dhsp.epm.br