Parâmetros Sorológicos e Controle de qualidade nos Imunoensaios Imunologia Clínica Parâmetros Sorológicos e Controle de qualidade nos Imunoensaios

Diagnóstico Clínico Epidemiológico Laboratorial

Imunoensaios ou Sorologia Por que fazer um Imunoensaio? Diagnóstico Laboratorial Imunoensaios ou Sorologia O que são Imunoensaios? São testes que se baseiam na detecção de Imunocomplexos (IC). Por que fazer um Imunoensaio?

Diagnóstico Laboratorial Diagnóstico de certeza de um processo infeccioso Demonstração do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos do hospedeiro. Métodos parasitológicos ou microbiológicos. Dificuldades: Ausência do agente infeccioso. Falta de sensibilidade dos métodos usados. Demora na liberação dos resultados.

Diagnóstico Laboratorial Métodos imunológicos - vantagens: Rápido Simples, com possibilidade de automação. Baixo custo operacional.

Importância da pesquisa de anticorpos no diagnóstico individual 1. Elucidar processos patológicos com sintomas e sinais clínicos semelhantes. Exemplos: Toxoplasmose e rubéola, toxoplasmose e mononucleose, hepatite B e hepatite C. ESPECIFICIDADE

2. Diferenciar a fase da doença. Em algumas patologias (fetopatias) é muito importante a identificação da fase da infecção. IgM: é o primeiro ac a ser formado, presente em processo agudos. (IgM residual). 3. Diagnosticar infecção congênita. IgM - anticorpo pentamérico, que não atravessa a placenta, sendo sua detecção importante no diagnóstico de infecção congênita. Presença de IgM no sangue do cordão umbilical: patognomônico da doença.

Presença de IgG no sangue do cordão umbilical: pode indicar um processo infeccioso, mas não é patognomônico da doença. Pode estar relacionada com a transmissão materno-fetal da Ig, e essa permanece na circulação do recém-nascido até o 5o ou 6o mês de vida. O acompanhamento do recém-nascido por vários meses, e a redução seguida por aumento gradual nos títulos dessa IgG (4 vezes o título) indicam doença congênita. Entretanto, essa definição tardia prejudica o tratamento. 4. Selecionar doadores de sangue: Triagem clínica, epidemiológica e sorológica. Sorologia: Chagas, sífilis, hepatites B e C, HIV, HTLV-I e HTLV-II.

4. Selecionar doadores de sangue: Testes utilizados devem apresentar alta sensibilidade. Discussão: Critérios de seleção quando são utilizados testes que pesquisam IgG (infecções passadas e já tratadas). 5. Selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes.

6. Avaliar o prognóstico da doença: Exemplo: Aparecimento de alguns anticorpos - hepatite B. 7. Avaliar a eficácia e suspensão da terapêutica: O sucesso do tratamento pode ser acompanhado de uma queda gradual nos títulos de anticorpos circulantes. VDRL - sífilis- os anticorpos anti-cardiolipina negativam com a cura. 8. Avaliar a imunidade específica naturalmente adquirida ou artificialmente induzida. Exemplo: Hepatite B.

Exemplo: Rubéola - existem sistemas automatizados que permitem estabelecer os níveis de anticorpos protetores em unidades internacionais. < 20UI/ml - negativo entre 20UI/ml e 30UI/ml - Acs presentes, porém não protetores. > 20UI/ml - Acs presentes e protetores. 9. Verificar o agravamento da patologia: Presença de IC (imunocomplexos) Presença de autoanticorpos.

Importância da pesquisa de anticorpos em inquéritos soroepidemiológicos 1. Estabelecer a prevalência da doença: A prevalência de determinada doença pode ser estabelecida pela presença de anticorpos IgG em amostras de sangue coletadas com rigoroso critério epidemiológico. 2. Verificar a erradicação da doença: A ausência de anticorpos contra um patógeno, em crianças nascidas no local, expostas às condições ambientais, é forte indício de erradicação da doença. O acompanhamento sorológico dessas crianças por um período de tempo é necessário para confirmação dos resultados.

3. Verificar a reintrodução de novos casos em áreas consolidadas: A presença de IgM ou o aumento nos títulos de IgG contra determinado microrganismo é indício de reintrodução da doença em áreas erradicadas.

Imunoensaios Reagentes não marcados: Menor sensibilidade de detecção, sendo necessária a formação de grandes complexos Ag-Ac. Exemplos: Precipitação e Aglutinação. Reagentes marcados: Ocorre uma amplificação do sinal, aumentando a sensibilidade de detecção. Exemplos: Radioativas, enzimáticas, fluorescentes e quimiofluorescentes.

Imunoensaios ou Sorologia Porque sorologia? Soro X Plasma. Aglutinação: Interferente do fibrinogênio – falso positivo. Ausência de Ca2+ livre – falso negativo.

Parâmetros Sorológicos O resultado de um teste de laboratório é um resultado de probabilidade que reflete a situação clínica do paciente no momento da colheita da amostra, e quando bem avaliado representa importante ferramenta de auxílio de que o clínico dispõe para a tomada de decisão ou para a mudança de hipótese clínica inicial. Para que isso seja verdade, é necessário saber interpretar os resultados em função dos limites do teste utilizado.

Parâmetros Sorológicos 1. Sensibilidade 2. Especificidade 3. VPP (Valor preditivo positivo) e VPN (Valor preditivo negativo). 4. Limiar de reatividade - “cut-off”

DOENÇA - diagnóstico verdadeiro presente ausente Tabela 1: Resultados prováveis obtidos em um determinado teste e o diagnóstico verdadeiro da doença. TESTE DOENÇA - diagnóstico verdadeiro presente ausente positivo negativo Positivos verdadeiros Positivos falsos Negativos falsos Negativos verdadeiros A B C D 1. Sensibilidade do teste Porcentagem de pacientes doentes com teste positivo detectados em população sabidamente infectada. Sensibilidade da técnica: limiar de detecção. Sensibilidade = A A + C

DOENÇA - diagnóstico verdadeiro presente ausente Tabela 1: Resultados prováveis obtidos em um determinado teste e o diagnóstico verdadeiro da doença. TESTE DOENÇA - diagnóstico verdadeiro presente ausente positivo negativo Positivos verdadeiros Positivos falsos Negativos falsos Negativos verdadeiros A B C D 2. Especificidade do teste Porcentagem de indivíduos “normais” com teste negativo em população sabidamente não infectada. Especificidade = D B + D

3. VPP e VPN VPP: Refere-se à probabilidade de doença se o resultado do teste é positivo. Se o resultado do teste é positivo, qual a probabilidade de que o indivíduo tenha realmente a doença? VPN: Refere-se à probabilidade de não ocorrência de doença se o resultado do teste é negativo. Se o resultado do teste é negativo, qual a probabilidade de que o indivíduo não tenha realmente a doença? VPP = A A + B VPN = D C + D

4. Limiar de reatividade - “cut-off” Reações cruzadas: Reações inespecíficas de anticorpos a diferentes estímulos antigênicos, principalmente relacionados com epítopos comuns encontrados em inúmeros microrganismos parasitos da microflora normal, ou em indivíduos poliparasitados. Para a determinação do limiar de reatividade, tem-se que saber a que se destina o teste. Banco de sangue: Teste com máxima sensibilidade - “cut-off” seria em menor diluição do soro. Este procedimento aumenta o número de falso +.

B = Máxima sensibilidade e especificidade 4. Limiar de reatividade - “cut-off” B = Máxima sensibilidade e especificidade Não infectado Infectado Ponto de Corte Diluição do soro b a A = Máxima sensibilidade c C = Máxima especificidade

Exemplo: Pesquisa de anticorpos anti-streptolisina O - látex Sensibilidade: 100% Especificidade: 94,7% VPP: 94,3% VPN: 100%

Imunoensaios e Efeito prozona A quantidade de Imunocomplexo formado depende de vários fatores físico-químicos e imunológicos, mas principalmente das concentrações relativas de antígeno e anticorpo. Ag + Ac Ag-Ac Prozona. Zona de equivalência. Pós-zona

Efeito pós zona Efeito prozona

Bibliografia Ferreira W.A.; Avila S.L.M. Diagnóstico Laboratorial das principais doenças infecciosas e autoimunes - Guanabara Koogan. Vaz J. A.; Takei K.; Bueno C. E. Imunoensaios Fundamentos e Aplicações - Guanabara Koogan.