SNPs e suas aplicações Karine Begnini Doutoranda em Biotecnologia UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA DE GENÔMICA II SNPs e suas aplicações Karine Begnini Doutoranda em Biotecnologia

X X S INGLE N UCLEOTIDE P OLYMORPHISM CONCEITO Variação genômica mais abundante S INGLE 90% das variações genômicas são SNPs N UCLEOTIDE 1 a cada 300 nucleotídeos  10 milhões no genoma humano P OLYMORPHISM Ocorrência NATURAL X X MUTANTE ou MUTAÇÃO

1% Posições de base única no DNA genômico, em que ocorrem diferenças nos ALELOS de um mesmo gene, em indivíduos normais de uma população.

CONCEITO Mutações pontuais (INSERÇÃO/DELEÇÃO) não são SNPs! cSNP: bases variantes que ocorrem no cDNA (RNA) Podem ocorrer em qualquer parte do genoma, mas são mais frequentes em regiões não codificantes

CLASSIFICAÇÃO Bi/Di-alélicos  dois alelos diferentes* NÚMERO DE ALELOS Bi/Di-alélicos  dois alelos diferentes* Tri-alélicos  três alelos diferentes Tetra-alélicos  quatro alelos diferentes

2/3 de todos os SNPs são C-T CLASSIFICAÇÃO TIPO DE BASE Transição  substituição de uma purina por outra purina (C-T) ou de uma pirimidina por outra pirimidina (G-A) Transversão  substituição de uma purina por uma pirimidina (C-A) (C-G) (T-A) (T-G) 2/3 de todos os SNPs são C-T

Missense: Nonsense: EFEITOS NA TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO POLIMORFISMO SINÔNIMO OU SILENCIOSO Substituição do nucleotídeo resulta em um códon que codifica o MESMO aminoácido (e portanto proteínas IGUAIS) POLIMORFISMO NÃO SINÔNIMO Substituição resulta em um novo códon (proteínas ALTERADAS) Missense: alteração no códon modifica o aminoácido Nonsense: alteração no códon resulta em um stop códon

Códon no RNA GAU para GUU Aminoácido Aspartato para Valina DNA SNP T para A Códon no RNA GAU para GUU Aminoácido Aspartato para Valina Mudança na proteína Aspartato Valina mRNA C T G A U G U U GAU GUU C A A

MEDICINA INDIVIDUALIZADA IMPORTÂNCIA “Combustível” que dirige a evolução Somente ~15% dos SNPs são comuns aos demais primatas Resposta a tratamentos médicos MEDICINA PREVENTIVA Suscetibilidade a doenças MEDICINA INDIVIDUALIZADA

MARCADORES BIOLÓGICOS MEDICINA INDIVIDUALIZADA APLICAÇÕES MARCADORES BIOLÓGICOS MEDICINA INDIVIDUALIZADA Câncer Doenças Cardiovasculares Doenças Degenerativas Diabetes Problemas Reprodutivos

MEDICINA DE POPULAÇÕES APLICAÇÕES MEDICINA DE POPULAÇÕES Marcadores genéticos de regiões associadas a doenças/características relacionadas a populações específicas AGROPECUÁRIA Marcadores genéticos pra doenças Reprodução e Produtividade

APLICAÇÕES

TRABALHOS GPO Pro/Pro CCC PROLINA Pro/Arg CGC ARGININA Arg/Arg Arg72Pro SNP da p53: Pro/Pro CCC PROLINA Pro/Arg CGC ARGININA Arg/Arg

PROLINA ARGININA Arg72Pro SNP da p53: indivíduos pele negra histórico familiar câncer PROLINA ARGININA sem histórico câncer baixo peso ao nascer indivíduos pele branca

TRABALHOS GPO Pro/Pro PROLINA CCC Pro/Arg ARGININA CGC Arg/Arg Arg72Pro SNP da p53: Pro/Pro PROLINA CCC Pro/Arg ARGININA CGC Arg/Arg

PRO/ARG ARG/ARG Arg72Pro SNP da p53: alta associação com aborto baixa associação com aborto

APLICAÇÕES TRABALHOS GPO

MÉTODOS DE DETECÇÃO

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO SEQUENCIAMENTO Seqüenciamento Sanger, seqüenciamento de segunda geração (Roche 454, Solexa-Illumina; Solid; Pirosequenciamento) Vantagem: avaliação de muitos SNPs ao mesmo tempo Desvantagem: custo elevado; interpretação errônea dados.

PCR RFLP O fragmento de gene contendo o SNP de interesse é amplificado com primers específicos por PCR, purificado e submetido a um tratamento com uma enzima de restrição (digestão) que reconheça apenas um dos alelos. Posteriormente, os fragmentos são separados por eletroforese para diferenciação dos alelos por tamanho.

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO digestão – AciI ou SfcI sangue DNA PCR eletroforese an á lise em gel 36 C 2h Clivagem ezimática BstU I de agarose

Pro/Pro Arg/Arg Pro/Arg PCR RFLP Arg72Pro SNP da p53: Pro/Pro Arg/Arg Pro/Arg

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO PCR RFLP Vantagens: não requer equipamentos avançados simples Pro/Pro Arg/Arg Pro/Arg Desvantagens: Extremamente laboriosa Um único SNP por vez Existência de enzima de restrição que diferencie os dois alelos

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO Hibridização – real time PCR Sonda Taqman®: detecta sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados por PCR.

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO Hibridização – real time PCR Vantagens: Extremamente precisa e rápida Análise de muito SNPs por reação Desvantagens: Bastante cara Necessita equipamentos mais complexos Sonda específica pra cada SNP

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO Outras técnicas Microarranjos de DNA Espectometria de massa Microssatélites

BANCOS DE DADOS

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO FUNCIONALIDADE

OBRIGADA! karibegnini@gmail.com