Imunohistoquímica na Detecção do Câncer: Mecanismos e Aplicações Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise Discentes: Lilian Campos Pires Marina Curado Valsechi

Sistema Imune: Reações antígeno-anticorpo Células e tecidos Sistema Imune: Reações antígeno-anticorpo Imunohistoquímica Imunologia Histologia Química Reações químicas Conjugação de distintos marcadores, com moléculas de imunoglobulina, que com auxílio de um substrato específico localiza o antígeno tecidual

Conjunto de métodos de detecção de antígenos em corte histológico Imunohistoquímica Conjunto de métodos de detecção de antígenos em corte histológico Processo de fixação Detecção de estruturas bioquímicas; Localização de antígenos em células utilizando anticorpos específicos; Produto da reação é visível ao microscópio;

Definições Antígeno: qualquer substância que sob condições apropriadas é capaz de estimular a formação de anticorpos. Anticorpo: proteína que é formada em resposta à exposição de um antígeno e reage especificamente com esse formando imunocomplexos. Epítopo Determinante antigênico, o sítio exato de ligação do anticorpo na molécula do antígeno

Sítio de Ligação ao antígeno Anticorpos Sítio de Ligação ao antígeno

Anticorpos Monoclonal Policlonal Único clone de célula produtora de anticorpos Múltiplos clones de célula produtora de anticorpos Possuem sítios de ligação ao antígeno idênticos Possuem diversas especificidade antigênicas

Reconhecimento do antígeno pelo anticorpo Mecanismo Básico Reconhecimento do antígeno pelo anticorpo Substâncias são utilizadas para “tingirem” essa ligação

Molécula colorida + Px + H2O Métodos Métodos utilizados para marcar anticorpos: Conjugação com composto fluorescente; Conjugação com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispensa elétrons (ouro ou prata); Conjugação com uma enzima; Peroxidase Px + H2O2 Px. H2O2 + doador de elétrons (cromogênico) Molécula colorida + Px + H2O

Métodos Cromógeno, mas o mais utilizado é o diaminobenzidina (DAB): Específico para Peroxidase; Origina um precipitado marrom, visível ao microscópio óptico; Carcinoma ductal

Métodos Direto Indireto Anticorpo primário é marcado diretamente por uma enzima Anticorpo primário serve como antígeno para o anticorpo secundário Anticorpo secundário Anticorpo Primário Anticorpo marcado

Métodos 1. Método da Peroxidase-Antiperoxidase Complexo Peroxidase-antiperoxidase: estáveis e sensíveis Evitar a perda da peroxidase durante as lavagens com a solução tampão Produto final com DAB é acastanhado Anticorpo secundário Complexo PAP Sistema PAP contém anticorpos de alta afinidade para peroxidase Aumento da eficiência

1. Método da Peroxidase-Antiperoxidase

Anticorpo secundários Métodos 2. Método Avidina-Biotina Biotina Conjugada a anticorpo e enzimas Complexo ABC Anticorpo secundários Conjugados Biotina Ligações entre o tecido ligados anticorpos primários e um complexo avidina-biotina-peroxidase

2. Método Avidina-Biotina

Métodos 3. Método Streptavidina-Biotina Anticorpo secudário biotinilado Anticorpo primário Streptavidina conjugada com peroxidase Um anticorpo primário associado com múltiplas moléculas de peroxidase. Grande razão enzima-anticorpo Aumento de sensibilidade

3. Método Streptavidina-Biotina

Aplicações Procedimentos de imunohistoquímica: Secções de parafina Esfregaço Suspensões celulares

Características de um fixador Procedimento da Técnica 1. Coleta e fixação do material Fixação Formol Preservar a morfologia e imunorreatividade; Prevenir o deslocamento do antígeno durante as etapas que seguem a fixação; Não interferir com as reações subseqüentes na localização do antígeno; Características de um fixador

Coagulação de Proteínas Com adição de Metais Pesados Procedimento da Técnica Soluções fixadoras Alcóolicas Coagulação de Proteínas Carnoy 70% etanol 20% clorofórmio 10% ac. acético Metacarn 70% metanol 20% clorofórmio 10% ac. acético glacial Aldeídicas Pontes Covalentes Formaldeído 4-10% Paraformaldeído 4% PLP Periodato-lisina-formaldeído Glutaraldeído Com adição de Metais Pesados Zinco: antígenos de membrana Mercúrio-B5: Ig intracelulares

Procedimento da Técnica 2. Corte e Identificação do Material Cassete Corte Identificação

Procedimento da Técnica 3. Desidratação Pouco efeito na imunorreatividade da maioria dos antígenos. 1ª : álcool 70% 2ª : álcool 80 % 3ª : álcool 95 % 4ª : álcool absoluto (3X) 4. Clarificação Xilol (2X) 5. Inclusão Parafina (2X) Não se deve ultrapassar a temperatura de 60°C quando da inclusão em parafina.

Procedimento da Técnica 6. Corte histológico Secagem na estufa 60°C por 24h

Bloqueio da peroxidase endógena Recuperação Antigênica Procedimento da Técnica Bloqueio da peroxidase endógena Recuperação Antigênica Desparafinização Xilol I Xilol II Etanol absoluto Etanol 95% Etanol 70% Peróxido de hidrogênio 3% Lavar as lâminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS) com pH de 7,4 à 7,6 por 30 minutos Solução de tripsina 0,1% por 10 minutos à 37ºC em câmara úmida Lavar as laminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS)

Bloqueio da Peroxidase Endógena Procedimento da Técnica Bloqueio da Peroxidase Endógena Pode ocorrer interferências pela ação de enzimas endógenas; Ligação inespecífica de anticorpos com as proteínas do tecido; Principais causas de coloração de fundo sem especificidade e indesejável em imunohistoquímica. Necessárias reações para bloqueio destas moléculas.

Recuperação Antigênica Procedimento da Técnica Recuperação Antigênica Falhas nesse procedimento podem acarretar na total ausência de coloração específica. Solução Tampão (Citrato) aquecida: 95°-99°C 30-40 min Lâminas resfriarem

Incubação com anticorpo Procedimento da Técnica Incubação com anticorpo Aplicação do Ac. Primário (1h à 37°C) Aplicação do Ac. Secundário Biotinilado (30 min à 37°C) Aplicação do Reagente Peroxidase (20min à 37°C)

Pinga o cromógeno, DAB, na lâmina Procedimento da Técnica Pinga o cromógeno, DAB, na lâmina Contra-coloração Hematoxilina Álcool 95% Álcool Absoluto Xilol Monta as Lâminas

Resultado da Técnica Receptor de Estrogênio Marcação nuclear GFPA Oncoproteína c-erbB-2 Marcação de membrana GFPA Marcação citoplasmática

Resultado da Técnica E-caderina É uma proteína que confere aderência às células e é de grande importância na diferenciação epitelial. É um potente supressor de invasão nos tumores mamários e a perda da sua expressão tem relação com um prognóstico ruim Expressão de E-caderina na membrana e citoplasma Expressão de E-caderina em carcinoma mamário

Marcadores de proliferação celular Resultado da Técnica Marcadores de proliferação celular Ki-67 PCNA Presente nas fases G1, S, G2 e mitose; Proteína associada à cromatina; Correlação positiva com metástase; Mostra células em replicação; Quanto maior a proliferação, mais agressiva é a lesão; Maior síntese na Fase S; Proteína associada ao reparo de DNA; Célula está em processo ativo de divisão celular ou em processo de reparo do DNA;;

Marcadores de proliferação celular Resultado da Técnica Ki-67 PCNA Marcadores de proliferação celular

Anticorpos para camada basal mioepitelial em tumor de mama Resultado da Técnica Anticorpos para camada basal mioepitelial em tumor de mama Actina de musculo liso Citoqueratinas 5-6

Como considerar positivo e como relatar o resultado??? Resultado da Técnica Como considerar positivo e como relatar o resultado??? Ausência ou menos de 10% de imunopositividade na membrana citoplasmática das células tumorais: = 0 = Negativo Imunopositividade fraca em parte da membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais: = 1+ = Negativo Imunopositividade fraca a moderada em toda a membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais: = 2+ = Fracamente positivo Imunopositividade intensa em toda a membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais: = 3+ = Fortemente positivo

Receptor para o fator de crescimento epitelial (EGF-R). Resultado da Técnica Oncoproteína c-erbB-2 Receptor para o fator de crescimento epitelial (EGF-R). A. 1+ B. 2+ C. 3+ Negativo Positivo A C B

Resultado da Técnica +1 +2 +3 Câncer de mama

“O Câncer é, em essência, uma doença genética”. Imunohistoquímica e Câncer “O Câncer é, em essência, uma doença genética”. Kenneth W. Kinzler e Bert Vogelstein

Reparo e apoptose ineficientes Imunohistoquímica e Câncer Carcinógeno Luz solar Radiação Derivados de petróleo Corantes e conservantes Hormônios Fumo Poluição Vírus, etc... Célula Normal Reparo Lesão ao DNA Reparo X Apoptose Reparo e apoptose ineficientes Mutações adicionais

Imunohistoquímica e Câncer

Imunohistoquímica e Câncer Células tumorais benignas crescem localmente e não têm capacidade invasiva Células tumorais agressivas invadem tecidos vizinhos, caem na corrente sanguínea e colonizam diferentes sítios Mutação inativa supressor de tumor Proliferação celular Mutação inativa genes do reparo Proto-oncogene Oncogene Mais mutações Mais instabilidade genética Metástases

Imunohistoquímica e Câncer Aplicações em câncer Diagnóstico de tumores indiferenciados; Diagnóstico diferencial entre tumores e estados reacionais a inflamações; Determinação de fatores preditivos de neoplasias; Determinação de fatores prognósticos de neoplasias; Determinação de sítio primário de metástases; Determinação de subtipos de leucemias e linfomas.

Imunohistoquímica e Câncer Imunohistoquímica no diagnóstico de câncer de pulmão Carcinoma de grandes células Carcinoma neuroendócrino Câncer de pulmão Carcinoma de células escamosas adenocarcinoma Baixo grau Cromogranina no citoplasma Alto grau CK5 CK6 de alto peso molecular 34βE12 CK5 CK6 Citoqueratinas de baixo peso molecular 35βH11 Negativos para p65 Positivos CK5 CK6 CK7 SP-A Sinaptofisina no citoplasma

Imunohistoquímica e Câncer Imunohistoquímica no prognóstico de câncer de pulmão p53 Adenocarcinoma c-erbB-1 Expressão relacionada com pior prognóstico Carcinoma de células escamosas VEGF Carcinoma não-pequenas células Expressão relacionada com prognóstico favorável C-erbB-2 Adenocarcinoma

Imunohistoquímica e Câncer Adenocarcinoma – citoqueratinas de alto e baixo peso molecular Adenocarcinoma – citoqueratina CK7 Tumor carcinóide

Imunohistoquímica e Câncer Adenocarcinoma primário Origem mesenquimal

Imunohistoquímica e Câncer EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES PCNA, Ki67 E P53 EM CARCINOMAS EPIDERMÓIDES DO TRATO AERODIGESTIVO SUPERIOR Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões — Vol. 27 – no 5 — 327 Parâmetros usados para classificar este tipo de tumor são muito subjetivos e os tumores apresentam comportamento muito heterogêneo Necessidade de se encontrar novos procedimentos capazes de melhor classificar este tipo tumoral IHQ para os genes PCNA, Ki67 e P53

Imunohistoquímica e Câncer OBJETIVO Correlacionar a expressão IHQ dos marcadores de proliferação PCNA e Ki67 e de supressão tumoral P53, com parâmetros prognósticos clínicos e patológicos em carcinomas epidermóides do trato aerodigestivo superior.

Adenocarcinoma gástrico Imunohistoquímica e Câncer MÉTODO Controles positivos Carcinoma de mama Ki67 e P53 Adenocarcinoma gástrico PCNA Controles negativos Lâminas sem anticorpo Pesquisador único Periferia do tumor 200 células núcleos positivos Grupo como um todo Correlação de Pearson Grupo A –laringe e hipofaringe Grupo B – cavidade oral e orofaringe

Imunohistoquímica e Câncer RESULTADOS Ki67 Expressão em todos os tumores 5,5% a 95% dos núcleos positivos 46,5% Total 58,5 % Grupo A 35% Grupo B PCNA Expressão em todos os tumores 10,5% a 98% dos núcleos positivos 66,5% Total 69% Grupo A 64% Grupo B P53 Expressão em 44 tumores (86.27%) 0,5% a 96,5% dos núcleos positivos 36,5% Total 37% Grupo A 35,5% Grupo B

Imunohistoquímica e Câncer CONCLUSÃO A determinação imunohistoquímica do Ki67 e PCNA pode subsidiar as informações prognósticas do TNM (AJCC) e do grau de malignidade histológico, como eficientes indicadores de proliferação celular nestes tipos de tumores.

Imunohistoquímica e Câncer Impacto prognóstico da expressão imuno-histoquímica do BRCA1 nos carcinomas mamários esporádicos J Bras Patol Med Lab • v. 41 • n. 3 • p. 197-203 • junho 2005

Imunohistoquímica e Câncer BRCA1 Gene supressor tumoral Participa da regulação do ciclo celular nas células da glândula mamária Mutações nesse gene levam a defeito no reparo do DNA e instabilidade genética Pacientes com mutações no BRCA1 Menor tempo de sobrevida livre de doença Perfil fenotípico característico Carcinoma pouco diferenciado Alta taxa de proliferação

Imunohistoquímica e Câncer OBJETIVO Analisar a expressão IHQ do BRCA1 em carcinomas mamários esporádicos e comparar os resultados obtidos com dados clínicos e histopatológicos de importância prognóstica, incluindo a expressão de receptores hormonais, p53, c-erbB-2 e Ki67.

Amostras – Carcinomas ductais invasivos Imunohistoquímica e Câncer MATERIAL E MÉTODO Grau I bem diferenciado (34) Grau II moderadamente diferenciado (39) Grau III pouco diferenciado (29) Amostras – Carcinomas ductais invasivos Sem qualquer outro tratamento adjuvante Sem história familiar Método avidina-biotina-peroxidase BRCA1, P53, c-erbB2, Ki67

Imunohistoquímica e Câncer RESULTADOS BRCA1 Epitélio normal - somente nuclear Carcinomas - nuclear e citoplasmática Expressão maior nos tumores bem diferenciados

Imunohistoquímica e Câncer

Imunohistoquímica e Câncer 51% dos carcinomas baixa expressão do BRCA1 Alto grau histológico Alta taxa proliferativa alta expressão do Ki67 Negativos para receptores de estrógeno e progesterona Positivos para c-erbB2 Menor sobrevida global Menor tempo livre de doença ( metástases e recidiva) A baixa expressão do BRCA1 está associada a ocorrência de metástases Papel na progressão tumoral do carcinoma esporádico

Imunohistoquímica e Câncer CONCLUSÃO A IHQ do BRCA1 pode representar um método de identificação deste gene que pode ser considerado um marcador útil na identificação de mulheres portadoras de carcinoma esporádico de mau prognóstico e alto risco de recorrência precoce.

Imunohistoquímica e Câncer CONCLUSÃO A baixa imunoexpressão desta proteína nesses tumores e a sua correlação com fatores de mau prognóstico indicam que o grau de expressão deste gene pode desempenhar importante papel na tumorigênese mamária

OBRIGADA !! Versos negros (mas nem tanto...) Carlos Drummond de Andrade “ Ao levantar, muito cuidado, amigo. Não ponha os pés no chão. Corre perigo Se há nylon no tapete: ele dá câncer. Pise somente no ar, mas com cautela. Uma pesquisa nos revela Esta triste verdade: o ar dá câncer. À hora do café, não seja pato, Pois tanto açúcar como ciclamato E xícara e colher, sorry: dão câncer. O banho de chuveiro? Não tomá-lo. O de imersão, também. Sinto informa-lo Do despacho londrino: água dá câncer. Não se vista, meu caro ou minha cara Um cientista famoso eis que declara: Na roupa, qualquer roupa, dorme o câncer...” OBRIGADA !!