Yeast vectors for integration at the HO locus Warren P. Voth, James D. Richards, Janet M. Shaw and David stillman Nucleic Acids Research, 2001. Vol 29, No. 12 e29 Apresentado por Fernanda Bezerra

INTRODUÇÃO Levedura Saccharomyces cerevisiae - integrações estáveis - Superexpressão de genes; Plasmídeos integrativos (YIp): marca URA3 - sequência de plasmídeo entre 2 cópias da sequência URA3; Dificuldades da estratégia: - uso de marcadores - recombinação entre as sequências repetidas em tandem; Perda da sequência integrada;

INTRODUÇÃO # Solução: Construção de plasmídeos que dirigem a integração para o locus HO; - sem duplicação em tandem de sequências; - uso das marcas KanMX4 ou hisG-URA3-hisG. Locus HO: - endonuclease (diploidização); - não necessário ao crescimento; - linhagens laboratoriais – mutação neste locus; - interrupção do gene HO – não altera a taxa de crescimento.

MATERIAIS E MÉTODOS # Plasmídeo pUC (plasmid universal cloning) - Mutação inesperada – origem de replicação; - gene LacZ; - presença de polylinkers - marca de resistência - AmpR pUC21 pUC21ΔBB - retirada dos sítios BamHI e BglII;

MATERIAIS E MÉTODOS pUC21ΔBB pUC21-NotI - inserção do polylinker NotI (123 pb) - fragmento do plasmídeo pFA6b

pUC21-NotI plasmídeo HO – poly – HO - Amplificação dos fragmentos HO-L E HO-R HO-L: Sítios HinDIII e BsiWI (912 pb) – região promotora HO-R: Sítios EcoRI e SfiI (507 pb) – região 3´- HO “Sticky end PCR” Protein Sci. 2002 11: 1714-1719

MATERIAIS E MÉTODOS pUC21-NotI plasmídeo HO – poly – HO - Fragmento HO-R: digestão de pUC21-NotI com EcoRI e SfiI; - Fragmento HO-L: digestão de pUC21-NotI com HinDIII e BsiWI.

# Plasmídeo HO – Poly – KanMX4 – HO MATERIAIS E MÉTODOS # Plasmídeo HO – Poly – KanMX4 – HO Fragmento KanMX4 BglII - EcoRI (1494 pb) – plasmídeo pFA6 Obs: No artigo, o autor cita a digestão do plasmídeo com as enzimas BsiWI e EcoRI, mas isto não faz sentido inclusive pela figura. A clivagem deve ter sido pelas enzimas BglII e EcoRI

MATERIAIS E MÉTODOS Plasmídeo HO – hisG-URA3-hisG - Poly – HO - Fragmento hisG-URA3-hisG (1494 pb) – plasmídeo pFA6 BamHI 5'-G^G A T C C-3‘ 3'-C C T A G^G-5' BglII 5'-A^G A T C T-3‘ 3'-T C T A G^A-5'

RESULTADOS E DISCUSSÃO # Plasmídeos pUC com diferentes polylinkers NotI – sitío de reconhecimento (8 pb) 5'-G C^G G C C G C-3‘ 3'-C G C C G G^C G-5' ORF LacZ – screening azul/branco para clonagem;

RESULTADOS E DISCUSSÃO # Plasmídeos para integração no locus HO fragmentos HO-R e HO-L: excisão do cassete de integração – NotI ou outra enzima de restrição; marcas de seleção: KamMX – raramente usada em manutenções de plasmídeos em leveduras, permite usar outras marcas para outras manipulações genéticas (URA3, HIS3, etc); Prototrofia a uracil: cultivo em meio contendo 5-FOA; recombinação entre as regiões hisG; Outros marcadores: nutricionais (HIS3, LEU2, TRP1) e resistência a drogas – inserção no plasmídeo HO-poly-HO;

RESULTADOS E DISCUSSÃO # Eficiência de integração no locus HO Linhagem DY131 – gene repórter HO-LacZ integrado no locus HO; seleção de clones por resistência a G418 (geneticina) parental X clone X-gal 14 transformantes – todos formando colônias brancas; clonagem de três genes no polylinker do HO – Poly – KanMX4 – HO 10 clones foram isolados – análise por PCR; 4 clones – caracterização da sequência interna do fragmento de inserção; Sticky end PCR – insertos com sítios de restrição presentes na região polylinker.

Obrigada!!!!

Recombinação entre sequências em tandem