ENZIMAS

ENZIMAS As enzimas são proteínas globulares solúveis sintetizadas pelos organismos vivos com a finalidade específica de catalisar as reações bioquímicas, que, de outro modo, não ocorreriam sob as condições fisiológicas habituais.

Com exceção de moléculas de RNA com propriedades catalíticas chamadas de RIBOZIMAS, todas as Enzimas são PROTEÍNAS

Características das Enzimas Apresentam alto grau de especificidade; São produtos naturais biológicos; Reações seguras; São altamente eficientes acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida); reduz a energia de ativação; Não são tóxicas.

Aceleram reações químicas As enzimas... Aceleram reações químicas Ex: Decomposição do H2O2 H2O2 H2O O2 + Catalase

Não são consumidas na reação H2O2 H2O O2 + Catalase E + S E + P

Atuam em pequenas concentrações decompõe 5 000 000 de moléculas de H2O2 pH = 6,8 em 1 min 1 molécula de Catalase Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo.

Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou  Chave-Fechadura , que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato.

Koshland (1958): Encaixe Induzido, enzima e o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição.

NOMENCLATURA E CLASSIFICAÇÃO

1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB)  nomear e classificar. Cada enzima  código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada: 1° dígito - classe 2° dígito - subclasse 3° dígito - sub-subclasse 4° dígito - indica o substrato

FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

pH; temperatura; concentração das enzimas; concentração dos substratos; presença de inibidores. ação do cofator

pH O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. Enzimas  grupos ionizáveis existem em diferentes estados de ionização.

Temperatura  temperatura causa dois efeitos: - a velocidade de reação aumenta; - a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. A temperatura ótima para que a enzima atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade constante por um período de tempo.

Concentração de Enzimas Desvios da linearidade ocorrem: Presença de inibidores na solução de enzima; Presença de substâncias tóxicas; Presença de um ativador que dissocia a enzima; Limitações impostas pelo método de análise. Recomenda-se: Enzimas com alto grau de pureza; Substratos puros; Métodos de análise confiável.

Concentração de Substratos [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P. Medir Vo = velocidade inicial da reação. vo Vmax [S]

Presença de Inibidores Inibidor é qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática. INIBIDORES REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS

COFATOR Moléculas pequenas Não proteicas Termo estáveis Derivadas de Vitamina B1 e B6, nucleotídeos

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Determinação da Atividade Enzimática As enzimas são medidas através de suas atividades catalíticas e seus resultados expressos em termos de quantidade de atividade presente em determinado volume ou massa da amostra - Quantidade do produto formado - Quantidade do substrato consumido

Determinação da Atividade Enzimática Comissão Enzimas da União Internacional de Bioquímica - Unidade Internacional (UI) – é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micromol de substrato/min.

APLICAÇÕES DIAGNÓSTICAS

Enzimologia Clínica É a aplicação da ciência das enzimas ao diagnóstico e tratamento das doenças.

DISTRIBUIÇÃO DAS ENZIMAS DE IMPORTÂNCIA DIAGNÓSTICA FONTES PRINCIPAIS PRINCIPAIS APLICAÇÕES CLÍNICAS ALT Fígado, músculo esquelético, coração Doença hepática parenquimatosa ALDOLASE Músculo esquelético, coração Doenças musculares AMILASE Glândulas salivares, pâncreas, ovários Doenças pancreáticas Fosfatase ácida Próstata, hemácias Carcinoma da próstata AST Fígado, músculo esquelético, coração, rim, hemácias Infarto do miocárdio, doença hepática parenquimatosa, doença muscular Colinesterase Fígado Envenenamento por inseticida organofosforado, doenças hepáticas parenquimatosa Creatino quinase Músculo esquelético, cérebro, coração, músculo liso Infarto do miocárdio, doenças musculares Fosfatase alcalina Fígado, osso, mucosa intestinal, placenta, rim Doenças ósseas, doenças hepatobiliares LD Coração,fígado,músculo esquelético, hemácias, plaquetas, linfonodos Infarto do miocárdio, hemólise, doenças hepáticas parenquimatosa

Enzimas x Laboratório Clínico Aplicação diagnóstica Aplicação prognóstica Acompanhamento das diversas patologias

Métodos para Determinação das Atividades Enzimáticas Métodos que analisam: Consumo de substrato Produto formado Variação de absorção da coenzima que participa da reação enzimática

Erros na Coleta da Amostra Uso de Anticoagulantes Hemólise Estase venosa Coagulação Lipemia

Erros na Conservação da Amostra Realizar o mais breve possível Conservar à 4°C Evitar congelamento da amostra

Determinação da Atividade Enzimática Importante Estabilidade do reagentes Pipetagem Limpeza da vidraria Controle de qualidade das análises

Enzimas nas Doenças Cardíacas AST – GOT - TGO ( Aspartato aminotransferase) Encontrada em concentrações elevadas no músculo cardíaco, fígado e músculos esqueléticos Em menor concentração nos rins e pâncreas Aumenta em lesões do parênquima hepático Eleva mais de 10 vezes na hepatite virótica aguda Na cirrose alcoólica ativa se eleva moderadamente

AST-GOT-TGO Catalisa especificamente a transferência do grupo amina do ácido aspártico para cetoglutarato AST L-Aspartato + cetoglutarato Oxalacetato + L-Glutamato MDH Oxalacetato + NADH Malato + NAD

Aspartato Aminotransferase AST – TGO Valores elevados são encontrados: Hepatite virótica crônica ativa Mononucleose infecciosa Hepatite aguda na fase de recuperação Disfunção hepática induzida por drogas Tumor hepático metastático Obstrução extra hepática Infarto do miocárdio

Aspartato Aminotrasferase AST –TGO Fatores Interferentes: Exercícios Anticoncepcionais orais Anti-hipertensivos Isoniazida Agentes colinérgicos Drogas hepatotóxicas

Enzimas nas Doenças Cardíacas Creatinoquinase (CK- CPK) pH ótimo: 6,8 no sentido da formação de ATP e 9,0 no sentido da fosforilação da creatina Encontrada no músculo cardíaco, na musculatura esquelética e no cérebro Aumentos podem ocorrer numa faixa de 60 a 100% com infarto agudo do miocárdio

Creatinoquinase (CK- CPK) Valores elevados são encontrados: Infarto agudo do miocárdio Miosites Distrofia muscular Exercício intenso Doença vascular cerebral Convulsões Alcoolismo crônico

Diagnóstico do Infarto do Miocárdio Isoenzimas de Creatinoquinase (CK) CK-BB (CK1) CK-MB (CK2) CK-MM (CK3)

Isoenzimas de Creatinoquinase (CK) CK-BB (CK1) Encontrada no cérebro e pulmão Eleva-se após embolia pulmonar, carcinoma de próstata e de pulmão Não é comum a elevação em distúrbios cerebrais

Isoenzimas de Creatinoquinase (CK) CK-MB(CK2) Fração híbrida de cadeias M e B Encontrada predominantemente no músculo cardíaco Determinação bastante específica para diagnóstico de infarto agudo do miocárdio Aumenta de 3 a 6 horas após a ocorrência do infarto com valor máximo em 12-24 horas Retorna ao normal em 24-48 horas

Isoenzimas de Creatinoquinase (CK) CK-MM(CK3) Compreende + de 95% da CK dos músculos esqueléticos Cerca de 70-75% da enzima do miocárdio Níveis elevados: Lesão, hipóxia do músculo esquelético (exercício intenso, traumatismo, inflamação)

Isoenzimas de Creatinoquinase (CK) Drogas que causam aumento no soro: Ampicilina Anfotericina B Alguns anestésicos Lítio Lidocaína

Desidrogenase Láctica LDH – LD - DHL pH ótimo: 8,8 a 9,8 no sentido da formação de ácido pirúvico e 7,4 a 7,8 no sentido da formação de ácido láctico Encontrada no coração, hemácias, músculo esquelético, rim, cérebro, pulmões e tecido linfóide Não é indicador específico de doença hepática e cardíaca

Desidrogenase Láctica Valores elevados LD total: Anemia megaloblástica Carcinoma Infarto do miocárdio e pulmonar, cirrose Leucemia Hepatite aguda Icterícias obstrutivas Doenças do parênquima renal

Infarto Agudo do Miocárdio Importância Cerca de 50% óbitos no mundo 1/3 faixa etária de 35 a 65 anos Prevalência nos países industrializados Evolução diagnóstica com marcadores mais sensíveis e específicos Compreender a “Janela Diagnóstica”

Desidrogenase Láctica Isoenzimas de LD LD1: coração, hemácias e rins LD2: coração e sistema retículo endotelial LD3: pulmão e outros tecidos LD4: placenta e pâncreas LD5: fígado e músculos esqueléticos

Aplicação Clínica do Fracionamento da LD

Desidrogenase Láctica Fatores Interferentes Hemólise Álcool, anestésicos, aspirina ↑ Ácido ascórbico ↓

Marcadores Clássicos AST – década de 50 (substituído por CK) LD – década de 70 (mais sensível que AST), porém com janela diagnóstica tardia CK-MB com CK total mais indicada CK total aumenta de 65 a 100% no IAM Troponina

Troponina São proteínas estruturais envolvidas no processo de contração das fibras musculares esqueléticas e cardíacas. O complexo troponina é composto por três proteínas:troponina T, troponinaI e troponina C As troponinas T (cTnT) e I (cTnI) são marcadores bioquímicos mais específicos e sensíveis para o diagnóstico de lesão isquêmica do miocárdio.

Troponina Elevação dos níveis de cTnI no soro ocorre entre 4 e 6 horas após início da dor precordial Atinge um pico em 12 horas e permanece elevada por 3 a 10 dias após um evento isquêmico único A isoenzima CK-MB só se eleva após lesão isquêmica irreversível As troponinas são liberadas mesmo em situação de isquemia reversível

Mioglobina A mioglobina é uma proteína constituinte das células dos músculos esquelético e cardíaco. Proteína liberada para a circulação precocemente após lesão isquêmica da fibra miocárdica. Concentrações elevadas são observadas 1 a 2 horas após o início da dor, atingindo o pico em 12 horas e, em geral, normalizando 24 horas após um episódio único.

Mioglobina Elevação de mioglobina circulante não é específica de lesão cardíaca, ocorrendo no trauma da musculatura esquelética e na insuficiência renal.

Importância da coleta seriada de amostras Devem ser coletadas amostras seriadas, em geral, na admissão, 3, 6 e 9 horas. Dosagens seriadas de cTnI, resultados do eletrocardiograma e a condição clínica são necessários para o diagnóstico diferencial entre infarto agudo do miocárdio e outras doenças cardíacas. NACB - National Academy of Clinical Biochemistry propõe o uso de dois marcadores para o diagnóstico de infarto agudo do miocárdio: a mioglobina, como marcador precoce e uma das troponinas (cTnT ou cTnI) como definitivo.

Características da dinâmica de elevação, pico e retorno aos níveis basais dos marcadores cardíacos.

Sensibilidade clínica estimada dos marcadores de isquemia miocárdica, levando-se em conta o tempo após o início da dor precordial.  

Enzimas de maior utilidade Diagnóstica Creatino Quinase – CK Doenças do músculo esquelético Distrofia muscular progressiva Doenças musculares neurogênicas Doenças do coração Infarto miocárdio Outras doenças cardíacas Troponina Mioglobina