CITOMETRIA DE FLUXO Aplicações práticas Patrícia Cisneiros dos Santos Bióloga- UCSAL Mestranda do curso de Imunologia-UFBa

PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO CITO METRIA FLUXO Célula Medida Movimento Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

ANTICORPOS MONOCLONAIS

ANTICORPOS MONOCLONAIS

CITÔMETRO DE FLUXO CITÔMETRO DE FLUXO SISTEMA FLUIDO SISTEMA ÓTICO SISTEMA ELETRÔNICO

SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA SISTEMA FLUIDO CÂMARA DE FLUXO FOCO DO LASER CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA

FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH” LOW DIFFERENTIAL PRESSURE HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE Laminar Flow Sheath Low Sample Pressure 12µl/min High Sample Pressure 60µl/min Laminar Flow Sheath Sheath Sample Sample

SISTEMA ÓPTICO SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER. A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER. UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.

SISTEMA ÓTICO FACSCalibur . FL1 530/30 SSC 488/10 FL2 585/42 90/10 Beam Splitter FL4 661/16 DM 560SP DM 640LP Half Mirror 670LP Fluorescence Collection Lens FL3 . Flow Cell Beam Combiner 488 nm Blue Laser Red Diode Laser ~635 nm FSC Diode 488/10 Focusing Lens

Filtros Ópticos – coletar sinais de luz Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido. Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido. Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda específico. Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540 460 500 540 460 500 540 Filtro LP 500 SP 500 BP500/30 Detector – célula fotoelétrica

LASER ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA: A REFRAÇÃO DA LUZ NO ÂNGULO DE 950 É DENOMINADA ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL E REVELA A COMPLEXIDADE DO CONTEÚDO CITOPLASMATICO. A REFLEXÃO DA LUZ NA FAIXA DE 1 A 50 FORMA O ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL E REVELA O VOLUME DA CÉLULA. ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

SISTEMA ELETRÔNICO CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.

SISTEMA ELETRÔNICO A medida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro Parâmetro 1 FSC Parâmetro 2 SSC Parâmetro 3 FL1 Parâmetro 4 FL2 Parâmetro 5 FL3

FLUORESCÊNCIA O que é a fluorescência ? Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser Fluoresceína CO2H O O H  = 480 nm  = 530 nm Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior comprimento de onda Luz Incidente de maior energía Fluorocromo

FLUORESCÊNCIAS O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda  530 nm, que corresponde à luz verde. O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda  570 nm, o que corresponde à luz laranja. O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda  650 nm, o que corresponde à luz vermelha.

SISTEMA ELETRÔNICO

DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS DISPERSÃO POLIMORFONUCLEARES LINFÓCITOS MONÓCITOS DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS BLASTOS VOLUME (FS) GRANULOSIDADE (SS)

DISPERSÃO: Side Scatter Forward Light Scatter 200 400 600 800 1000 200 400 600 800 1000 Linfócitos Monócitos Neutrófilos

Visão dos dados coletados Side Scatter Forward Light Scatter 200 400 600 800 1000 CD3 FITC CD4 PE DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2

ALGUNS MARCADORES CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócitos. CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica. CD19- presente em mais de 95% das células B. CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico. CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO. CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.

LEUCEMIAS CD3 CD7 HLA DR CD 42a CD 61 CD19 CD33 CD13 CD14 CD34 Leucemias mielóides CD10 CD2 CD20 CD3 CD7 CD19 CD22 CD23 CD26 CD5 Leucemias Linfociticas ou Enfermidade residual mínima CD3 CD7 CD2 CD19 CD5 CD56 Linfomas e Mielomas

APLICAÇÕES CLÍNICAS - Análise da subpopulação linfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima - Análise de reticulócitos - Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Análise do conteúdo de DNA - Quantificação de células progenitoras (Stem cells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão linfocitária

OBRIGADA A TODOS! OBRIGADA A TODOS!