Culturas puras e características culturais

Apresentação em tema: "Culturas puras e características culturais"— Transcrição da apresentação:

1 Culturas puras e características culturais
Qdo microrganismos crescem em nutrientes preparados em laboratório, dá-se a eles o nome de culturas. Cultura mista: população ambiental, com várias espécies de bactérias e/ou fungos (ex: pele, intestino). Cultura pura: condição artificial, obtida em laboratório, única espécie está se multiplicando no meio de cultura. Obtida após uma sequência de procedimentos laboratoriais.

2 Cultura de bactérias - diagnóstico laboratorial de infecções
1o) Cultura de enriquecimento (nem sempre é necessária) 2o) Isolamento (p/ cultura pura) – semear esgotamento. 3o) Coloração de Gram (diferenciação dos dois principais grupos bacterianos) 4o) Seleção dos meios mais adequados a identificação do microrganismo isolado e repique nos meios escolhidos 5o) Leitura e Identificação da espécie - testes bioquímicos 6o) Antibiograma – teste sensibilidade aos antibióticos

3 Isolamento de Colônias
Isolamento (p/ cultura pura) – semear esgotamento em ágar (seletivo ou não) 1- Inóculo na lateral da placa 2- Com alça bacteriológica, estriar a superfície do meio, com traços sempre próximos mas não sobrepostos. Se o inóculo foi feito com a própria alça e estiver muito carregado, flambar antes de iniciar as estrias.

4 Coprocultura – Cultura de fezes
As gastroenterites podem ser causadas por bactérias, vírus ou parasitas. Quando a suspeita médica é de infecção causada por bactérias é solicitada uma coprocultura, são procurados os agentes etiológicos mais frequentes: Shigella sp Salmonela sp Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) - diarréias crianças até 4 anos E.coli enteroinvasora (EIEC) - todas as faixas etárias. Patogenicidade pela toxina que penetra na mucosa intestinal, provocando diarréia aguda.

5 Coprocultura Amostras: Preferencialmente fezes frescas
swab anal em gel de transporte fezes coletadas em meio de transporte (tampão glicerol). Os swabs com meio de transporte e as fezes conservadas em tampão glicerinado podem ser armazenados à temperatura ambiente por até 24 horas.

6 Coprocultura Cultivo Microbiológico:
Placas Agar Seletivo para Gram Negativos como: MacConkey SS (seletivo para Salmonela e Shiguella) incubadas 24h/37ºC As colônias típicas das espécies pesquisadas devem ser isoladas, identificadas e submetidas ao antibiograma. Esfregaço do material (fezes) e coloração de Gram, p/ observação da “diversidade bacteriana”: amostras normais - uma grande variedade de morfotipos bacterianos, com predomínio de bacilos Gram positivos (lactobacilos – flora normal intestinal) infecções - predomínio de um morfotipo apenas.

7 Isolamento de Colônias
Após a incubação no meio seletivo, deve-se observar as colônias e selecionar as “suspeitas”, de acordo com suas características no meio utilizado. Ex: Salmonella e Shigella em meio SS são pretas Transferir com agulha bacteriológica cada colônia suspeita para uma nova placa de meio e semear novamente por esgotamento, para obter a cultura pura (com um único tipo de colônia), que será então submetida à identificação

8 Identificação A maioria das bactérias causadoras de infecções intestinais são da família Enterobacteriaceae, composta por bacilos G-, fermentadores. A identificação deste grupo é baseada em características metabólicas como: Fermentação lactose (lac+ no MacConkey), fermentação da glicose com produção de ác. e gás, utilização Indol, do citrato, da lisina, presença de flagelos, etc..., dados obtidos através da série bioquímica com meios como EPM, MiLi e citrato

9 Meios para identificação
Agar MacConkey: Seletivo – inibe G + Diferencial – Resultados: fermentadores lactose – rosa (lac+) não fermentadores – amarelos (lac-) Tubo Citrato - inocular a superfície, incubar 24hs/35ºC Resultados: citrato + coloração azul (produção ác. evidenciada pelo indicador pH), uso do citrato que é única fonte de C neste meio

10 Inoculação e leitura dos meios p/ identificação de enterobactérias
Tubo MILI MiLi: Motilidade (semi-sólido – presença flagelo) Indol – reação com reativo de Kovacs Li – descarboxilação lisina - fazer picada central apenas e incubar 24hs/35ºC Resultados: Motilidade: as imóveis crescem apenas na linha de picada. Indol + formação anel vermelho com reativo de Kovacs Descarboxilação da lisina: lisina + o meio mantem-se roxo (neutraliza acido que deixaria amarelo por indicador de pH) Lisina -- meio amarelo

11 Inoculação e leitura meios de identificação enterobactérias
Tubo EPM - inocular picando até o fundo e semear na superfície - incubar 24hs/35ºC Resultados: Fermentação da glicose, produção de gás, H2S, uréia, fenilalanina. Interpretação do Meio EPM Produção de gás - formação de bolhas no meio Produção de H2S - pigmento negro Base Hidrólise da Uréia – urease + formação coloração azul Superfície Desaminação Triptofano - + formação coloração verde escuro

12 Identificação Comparar resultados das provas bioquímicas com informações sobre as espécies Ex: E. coli Lac+ Fermenta glicose produzindo ácido e gás, citrato neg, urease neg, etc... Para estas comparações utilizamos tabelas com % ou programas de computador

13 Coprocultura – outras espécies pesquisadas
Em casos mais específicos, como as pesquisas de Campylobacter sp e Yersinia sp, o pedido médico deverá ser direcionado. Outros patógenos, como Aeromonas sp e Plesiomonas sp, podem também ser isolados. O crescimento abundante de espécies como Pseudomonas aeruginosa, Candida sp, Staphylococcus aureus, pode indicar pacientes tratados com antibióticos de amplo espectro. Deve ser comunicada ao médico, indicando a sua predominância (alteração de microbiota)

14 Urocultura – cultura de urina
A urina normal é estéril, mas pode ser contaminada com microrganismos da flora cutânea na passagem através da uretra. As infecções urinárias estão entre as mais freqüentes, sendo que o sexo feminino é o mais afetado devido à proximidade do ânus com a abertura urinária (predominância de enterobactérias) Os agentes etiológicos da infecção do trato urinário (ITU) são principal/e: E. coli, Enterococcus sp, Klebsiella sp, Proteus sp (Enterobacteriaceae) Staphylococcus sp, Enterococcus sp (cocos G+) Pseudomonas sp (BG- não fermentedor) Na comunidade, cerca de 80% das ITU são causadas por E.coli. Em pacientes hospitalizados, a Candida sp, pode ser o agente de ITU

15 1) Cuidados p/ evitar contaminação microbiota cutânea:
Urocultura - Coleta 1) Cuidados p/ evitar contaminação microbiota cutânea: realizar higiene local utilizando uma gaze embebida em sabão neutro e água estéril morna, passar gazes com água estéril morna até a retirada do sabão e coletar a urina de jato médio em frasco estéril. Obs: Hidratação- é extremamente importante que os pacientes cientes que o excesso de líquido pode levar a resultados errôneos, através da diluição da urina, provocando uma falsa diminuição do número de UFC/ml. Tempo de retenção urinária: A amostra ideal para urocultura é a primeira da manhã. Caso não seja possível obter esta amostra, é desejável que o mantenha uma retenção urinária de no mínimo 4 horas.

16 Urocultura Procedimento: Cultura em Laminocultivo ou Placas Agar Cled (contagem de colônias), Agar Sangue e Agar Seletivo para Gram (MacConkey) 1- Homogeneização da urina, e semeadura por: . por imersão direta da lâmina na urina, ou . derramando-se a urina na superfície do meio se utilizar laminocultivo Semear com alça calibrada (plástica – descartável) por toda a superfície do meio quando cultivo em placa Alça calibrada 10μl (=0,010ml = 1 x 103 UFC/ml) 2- Incubar entre 35ºC e 37ºC, por até 48 horas, realizando a primeira leitura entre 18 a 24 horas. 3- Após incubação fazer a contagem das Unidades Formadoras de Colônias (UFC)/mL no meio Cled e diferenciação em Gram+/- (por características do meio de cultura e coloração) e seguir a sequência de meios de cultivo para identificação da espécie.

17 Urocultura Laminocultivo para urocultura Contagem de colônias
Lamincultivo 1: > 107 UFC/mL 2: 106 UFC/mL 3: 105 UFC/mL 4: 104 UFC/mL Laminocultivo para urocultura (verde: CLED; vermelho: MacConkey) MacConkey – colônias Lac + de coloração rosa (bacilos Gram -, fermentadores de lactose)

18 Urocultura Alça calibrada 10μl (=0,010ml = 1 x 103 UFC/ml)
Urocultura: Urina de jato médio - > colônias/ml  INFECÇÃO - < colônias/ml (10 x 103)  CONTAMINAÇÃO - entre e  suspeita de infecção (repetir) Outros indícios de ITU (na Urina I) Hemácias na urina (uma mistura de hemoglobinúria e hematúria) Leucócitos (piúria) Redução de Nitratos com formação de Nitrito INFECÇÃO DO TRATO URINÁRIO (ITU): Proliferação de bactérias na urina com manifestações de inflamação das vias urinárias baixas (cistite - uretrite) ou altas (pielonefrite).

19 Urocultura No caso de meio Chromogênico, a identificação é direta:
Cor típica da colônia Microrganismo* Vermelho E.coli Azul turquesa Enterococcus sp Azul metálico Klebsiella sp, Enterobacter sp, Citrobacter sp Halo marrom Proteus sp Creme, translúcida Pseudomonas sp Dourada, opaca, pequena Staphylococcus aureus Rosa, opaca, pequena Staphylococcus saprophyticus

20 Urocultura Confirmar identificação bioquímica (se necessário)
Antibiograma Mais de um tipo de colônia sugere contaminação, pois raramente há mais de um tipo bacteriano causando infecções no Trato Genito-Urinário. Solicitar nova coleta. Para o exame completo, urocultura e antibiograma, são gastos aproximadamente 4 dias.