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TIPOS DE MÉTODOS RÁPIDOS. MÉTODOS RÁPIDOS Os métodos rápidos tomaram impulso na década de 90 com o impacto dos custos crescentes com lead time para a.

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1 TIPOS DE MÉTODOS RÁPIDOS

2 MÉTODOS RÁPIDOS Os métodos rápidos tomaram impulso na década de 90 com o impacto dos custos crescentes com lead time para a liberação dos produtos para o mercado consumidor. Podemos dizer hoje que os métodos rápidos e a automação fazem parte de uma área dinâmica da microbiologia aplicada que tem como áreas principais:

3 MÉTODOS RÁPIDOS O isolamento dos microrganismos. A detecção precoce. A identificação dos microrganismos. A quantificação dos microrganismos.

4 Métodos rápidos identificação

5 MÉTODOS RÁPIDOS Métodos rápidos para identificação microbiana Vitek –depende do crescimento bacteriano, utilização de carbohidratos e substratos bioquímicos. Tempo de incubação 2 a 24 horas Capacidade de 30 a 60 amostras por dia Biblioteca > 350 especies bacterianas e leveduras

6 Métodos rápidos Métodos rápidos para identificação microbiana Biolog – depende do crescimento microbiano e baseia-se na utilização de carbohidratos Tempo de incubação – 2 a 72 horas Capacidade de 100 amostras por dia Biblioteca > 2000 espécies bacterianas e olores e leveduras

7 Métodos rápidos Métodos rápidos para identificação microbiana Phoenix – depende do crescimento microbiano, baseia-se na utilização de substratos bioquímicos e sensibilidade aos antibióticos Tempo de incubação - 3 horas Capacidade de 100 amostras por dia Biblioteca > 230 espécies bacterianas

8 Métodos rápidos Métodos rápidos para identificação microbiana MIDI – SHERLOCK MIS - baseia-se na identificação dos ácidos graxos extraídos de colônias isoladas. Tempo de análise de +/- 2 horas Capacidade de 100 amostras por dia Biblioteca de >1500 espécies bacterias e fungos e bolores.

9 Métodos rápidos Dupont Qualicon + Riboprinter – ribotipagem de fragmentos de DNA Pathogenetix- marcação fluorescente do DNA Capacidade de identificar culturas mistas Bilbioteca extensa > 1000 microrganismos Outras técnicas – Espectroscopia Raman FT-IR

10 Métodos rápidos MALDI-TOF ( MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION – TIME OF FLIGHT) Baseia-se na análise e detecção de um grande espectro de proteínas, capaz de discriminar espécies estreitamente relacionadas. A matriz utilizar as proteínas foi mudada para que possibilitasse as proteínas ribossomicas, Neste sistema os microrganismos são colocados em uma placa que contem uma matriz polimérica

11 Métodos rápidos A placa é irradiada com um laser que vaporiza a amostra ionizando as moléculas que são aspiradas e elevadas a um detetor. Dependendo da molécula o tempo de chegada será diferente (time of flight), os dados obtidos através destas leituras são comparados a uma base algorítimica que contém uma biblioteca possibilitando a identificação de bactérias, leveduras e fungos.

12 Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos Bioluminescência – técnica baseada no princípio da medição da quantidade de Adenosina trifosfato (ATP). E + LH2 +ATP → E-L2-AMP+ PP E-LH2-AMP + O2 → oxiluciferina + CO2 +AMP +LUZ E= Enzima luciferase, lh2 = luciferina, E-LH2- AMP = COMPLEXO LUCIFERASE-LUCIFERINA - AMP

13 Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos Equipamentos que utilizam a técnica do ATP - CELSIS,HITACHI,LONZA

14 Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos GeneDisc –Pall Corp. –princípio – amostras são filtradas em membrana e lisadas através de reagentes específicos –adiciona-se polimerase e desoxinucleotídeos em uma placa própria que contém os primers e os probes. Quando o DNA de interesse é amplificado,um sinal fluorescente do probe é detectado e medido. O equipamento vem com 6 probes que permite a realização do teste limite USP em até 1 hora.

15 Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos IMPEDÂNCIA-CONDUTÂNCIA – baseia-se na propriedades que os microrganismos têm de alterar a transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura. Exemplos Rabit, Malthus,Bactometer

16 Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos Outras técnicas disponíveis ´- light scattering, PCR. Testes de esterilidade – inoculação direta em meio de cultura, medição de CO2 BACTEC, BACT/ALERT

17 Métodos rápidos de alta sensibilidade Capacidade de detectar 1 célula – bactérias, leveduras, fungos e esporos. Carga microbiana de matérias primas, controle em processo, produtos acabados, água e testes de esterilidade. Vantagens sobre o teste tradicional 14 dias vs 1 a 3 horas Para amostras filtráveis.

18 Métodos rápidos de alta sensibilidade Millipore –Milliflex Rapid e Quantum Sensibilidade -1UFC após o crescimento Rapid –ATP Sensibilidade 1 UFC Tempo de incubação -24 horas Carga microbiana, matérias primas, produtos acabados, água e testes de esterilidade.

19 Métodos rápidos de alta sensibilidade Milliflex Quantum Sensibilidade 1 UFC Quantum –coloração vital, amostra é filtrada e a membrana é inoculada em meio contendo substrato fluorescente, que libera o fluorocromo no citoplasma celular. Um leitor permite a quantificação das colonias e mesmo a identificação dos microrganismos.

20 Métodos rápidos de alta sensibilidadee AES Chemunex D-Count e BactiFlow Sensibilidade 10 a 50 UFC Carga microbiana de matérias primas, controle em processo, produtos acabados e água. Coloração vital e citometria de fluxo

21 Métodos rápidos de alta sensibilidade Citometria de fluxo – o sistema marca o ácido nucléico com um corante fluorescente, sendo que a amostra é lida em um citometro de fluxo. Amostra filtrada em um filtro membrana,sendo que o microrganismo retido no filtro é marcado com um substrato não fluorescente O metabolismo microbiano atua enzimaticamente liberando o fluorocromo, possibilitando a detecção pelo laser.

22 Métodos rápidos de alta sensibilidade AES Chemunex –ScanRDI Sensibilidade 1 UFC Carga microbiana de matérias primas, controle em processo, produtos acabados, água e testes de esterilidade. Tempo 1,5 horas. Princípio – coloração vital e citometria de fase sólida.


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