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Amadeo Sáez-Alquézar Vitória 2008 Diagnóstico Laboratorial das Hepatites A, B e C.

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1 Amadeo Sáez-Alquézar Vitória 2008 Diagnóstico Laboratorial das Hepatites A, B e C

2 Hepatites por Vírus Até 1965 Hepatite Infecciosa Hepatite por soro homólogo Curto período de incubação Longo período de incubação A B

3 Hepatites Virais Hepatite por vírus AHAV Hepatite por vírus BHBV Hepatite por vírus CHCV Hepatite por vírus DHDV Hepatite por vírus EHEV Hepatites Não A-E HGV.. Vírus Epstein Bar, Citomegalovírus, Herpes, outros

4 VÍRUSFamília A Picornaviridae B Hepadnaviridae C Flaviviridae D Deltaviridae E Caliciviridae Hepatites Virais Mais Frequêntes

5 Características das Hepatites

6 Hepatites Não A-E Vírus da Hepatite G ou GB-C Agente etiológico HGVTTV Famíliaflaviviruscircovirus GenômaRNADNA Tamanho (nm)50 – – 50 EnvelopeSIMNÃO Marcadores HGV – RNA Anti-E2 TTV – DNA TransmissãoParenteral

7 Testes sorológicos. –Marcadores sorológicos (Ac, Ag). Testes de biologia molecular. –Amplificação de ácidos nucléicos. Testes bioquímicos. –Enzimas, pigmentos biliares, proteínas. Diagnóstico das Hepatites por Vírus

8 HAV e HEV Distribuição mundial Transmissão entérica (fecal-oral) Não apresentam formas crônicas Hepatite aguda grave: –HAV Crianças 2% –HEV:em gestantes 15 – 25%

9 Melhoria dos Padrões Sócio-econômicos e de Higiene. Em áreas endêmicas para HAV: A vacinação de crianças é mandatoria. A imunogenicidade da vacina para hepatite A é muito alta, obtendo-se 97% a 100% de soro conversão após uma única dose e de 100% com a segunda dose. Vacinar viajantes de áreas não endêmicas para áreas endêmicas. HAV: Prevenção da Infecção Vacinas: Havrix® e Vaqta®

10 Transmissão da HVA Por contato pessoal Doméstico, sexual, crianças em locais de estudo e recreação. Por água e alimentos contaminados. Pelo sangue (rara) Uso de drogas endovenosas. Transfusão sangüínea

11 HVA - Características Clínicas Período de incubação: 30 (15-50) dias Icterícia por faixa etária < 6 anos:< 10% 6 a 14 anos: 40 – 50% > 14 anos: 70 – 80% Complicações: raras Formas crônicas: ausentes

12 Distribuição geográfica da infecção pelo vírus da Hepatite A CDC

13 Estrutura icosahédrica Não envelopado Genoma: fita única de RNA –7500 nucleotídeos (3 regiões) –Região codificadora (P1 – P2 – P3) –4 proteínas virais: VP1, VP2, VP3 e VP4 Três Genótipos (15% de variações no VP1) Um único sorotipo HAV Estrutura e variabilidade genética P2: Proteínas nâo estruturais (2A, 2B e 2C) P3: Proteinas estruturais (3A, 3B, 3C e 3D)

14 Anti-VHA (IgM) –Anticorpos contra o VHA, subclasse IgM FASE AGUDA Anti-VHA (IgG) –Anticorpos contra o VHA, subclasse IgG RECUPERAÇÃO - IMUNIDADE Marcadores Sorológicos da Hepatite por Vírus A

15 VHA Nas fezes Viremia

16 Imuno Captura : IgM reverso Positivo HRP H 2 O 2 /TMB H 2 SO 4 anti-HAV (IgM), anti-HBc (IgM), anti-Delta (IgM) Fase sólida AgHAV

17 HVE Características Clínicas Período de incubação:: 40 (15 – 60) dias Formas graves: 1% - 3% –Gestantes: 15% - 25% Gravidade: aumenta com a idade Formas crônicas:: não identificadas. Paraná R & Schinoni MI

18 HEV – Características epidemiológicas A maioria dos surtos estão associados à ingestão de água contaminada com fezes. A transmissão, pessoa a pessoa, é mínima. Frequêntemente descrita em viajantes para áreas endêmicas.

19 Distribuição geográfica da infecção pelo vírus da Hepatite E Surtos de infecção confirmada em > 25% de hepatites esporádicas Não ABC CDC

20 Anti-HEV IgM –Fase aguda Diagnóstico Anti-HEV IgG –Recuperação Prevalência Marcadores Sorológicos para o Vírus da Hepatite E

21 Grupos Anti-HEV (IgG) (%) Anti-HAV (IgG) (%) Doadores de sangue (93) 4,392,5 Gestantes (304) 1,084,5 Área urbana (260) 031,2 Área rural (145) 2,179 Hemodiálise (65) 6,291 Usuários de drogas IV (102) 11,880,4 Prevalência de infecção por HEV e HAV - Rio de Janeiro TRINTA, Karen S, LIBERTO, Maria Isabel M, PAULA, Vanessa S de et al. Hepatitis E virus infection in selected Brazilian populations. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Jan. 2001, vol.96, no.1, p

22 A prevalência da infecção por HBV, no mundo, é estimada em torno de 4 – 5% da população total do planeta. –Portadores crônicos assintomáticos –Hepatite crônica (350 milhões) –Carcinoma Hepatocelular (HCC) Estima-se que ocorrem 50 milhões de novos casos, por ano, de infecção pelo HBV. Infecção pelo HBV

23 Distribuição Mundial da Infecção Crônica por HBV CDC

24 Exposição per cutânea e de mucosas a fluídos corporais contaminados. Contato sexual Transfusão sangüínea Transplante de órgãos Vertical (mãe p/ o recém nascido) Uso de agulhas e seringas contaminadas Acidentes em laboratório Formas de Transmissão do HBV

25 Infecção pelo HBV Adultos 80% Assintomática 20% Doença Aguda >1 % Hepatite Fulminante Crianças Quase sempre Sub-clínica 5-10% Infecção crônica Cirrose Hepato carcinoma Falência hepática Transplante ou óbito 30% 5% a 10% 23%Em 5 anos

26 Infecção Crônica por HBVInfecção Risco para desenvolver infecção crônica Risco para DesenvolverHCC Período perinatal > 90% 25% Crianças 1 a 5 anos 25 – 50% 25% Crianças (>5) Adultos 6 – 10% 15%

27 HBV - PREVENÇÃO Imunização passiva –Imuno globulina Proteção curta (2 – 3 meses) Imunização ativa –Vacina Proteção longa (anos) –Plasma purificado (1981) –Vacina recombinante (1986)

28 VACINA HBV Esquema –Três doses (0-1-6 meses) –Não é necessário reiniciar, se passou o tempo estabelecido entre as doses. Eficacia –Resposta adequada: anti-HBs > 10UI/ml Proteção (> 15 anos) –1ª dose: 30-50% - 2ª dose: 75% - 3ª dose: 96% –Menor em imunodeprimidos e idosos

29 Vírus da Hepatite B

30 Marcadores sorológicos da Hepatite por Vírus B AgHBs Anti-HBs AgHBe Anti-HBe Anti-HBc (IgM) Anti-HBc (IgG ou total)

31 HBV-DNA

32

33 Perfis Sorológicos Observados em Indivíduos Infectados pelo HBV Perfil Ag HBs Anti-HBcIgM Anti-HBc IgG Anti- HBs

34 1-Resultado falso positivo para o anti-HBc. Mais de 66% dos indivíduos com AgHBs negativo, anti-HBc positivo e anti-HBs negativo, quando submetidos à vacinação contra o HBV soroconvertem, com positividade para o anti-HBs, o que indicaria que o anti-HBc isolado correspondia a um resultado falso positivo. 2-Infecção passada pelo HBV e que após algum tempo desapareceu o anti-HBs. 3-O AgHBs está en níveis muito baixos, ou se encontra formando imunocomplexos com o anti-HBs, de modo que não pode ser detectado. 4-Mutantes AgHBs. Ainda que as provas para detecção do AgHBs apresentem alta sensibilidade, alguns testes podem não detectar mutantes. Interpretações para o anti-HBc (+) com AgHBs/anti-HBs (-)

35 HBV – DNA circular de hélice dupla parcialmente fechada e envelope lipídico Genoma: nucleotídeos 4 Regiões abertas para leitura SPCXSPCX

36 gene P Pré S1 Pré S2gene S gene CPré C AgHBe AgHBc AgHBs DNA Polimerase GENOMA DO HBV

37 HBV: Replicação e Variantes Replica seu genoma (DNA) via transcrição reversa do RNA pré-geonómico Inserção incorreta de nucleotídeos no cDNA Geração de quasiespécies Alta replicação viral: por dia Alta taxa de mutações

38 HBV – AgHBs – Variantes Subtipos –O AgHBs possui diversas proteínas –Determinantes antigênicos (a, d, y, w, r) Combinações: subtipos –Mais comuns: adw, adr, ayw. O determinante antigênico a é comum a todos os subtipos Genótipos –Baseados na divergência genética de 8%, ou mais, da sequência completa de nucleotídeos –Genótipos: A, B, C, D, E, F, G, H Mutantes

39 A A F A E D D C B C G G H Ba Bj AD B D Distribuição Geográfica Stuyver et al., J Gen Virol. 2000;81(1): deMan et al., J Hepatol. 1998;29(4): Baseados na divergência genética de 8% ou mais da sequência completa de nucleotídeos Genótipos A B C D E F G H A/D B/C Ba Bj Genótipos do HBV

40 Variantes do HBV Os subtipos e genótipos do HBV se originam de forma natural durante o curso da infecção pelo HBV –Consolidadas na natureza –Apresentam distribuição étnica e geográfica características

41 Mutantes do HBV 1.Gerados espontaneamente durante o curso da infecção natural pelo HBV 2.Gerados num ambiente de pressão seletiva Uso de imuno profilaxia ativa Uso de imuno profilaxia passiva Tratamento com anti-virais

42 Principais Mutantes do HBV Mutantes pré-Core ou Core promoter Achados em cepas mais virulentas Mutantes no gene P (polimerase) Resistência a anti-virais Mutantes no gene X Associados ao desenvolvimento de hepatocarcinoma Mutantes no gene S Modificam os epítopos imunodominantes do determinante antigênico a

43 Principais Mutações do HBV Na região pré core do DNA-HBV (mutantes de escape do AgHBe) –Falha na expressão do AgHBe a partir da região Pré- Core Ex: aa gly, substituído pelo aa arg [PCR DNA-HBV (+) e AgHBe (-)] Resistência aos anti-virais –Mutações na Polimerase Lamivudina Adefovir

44 Estrutura antigênica do AgHBs O envelope do HBV contem 3 proteínas (complexo AgHBs) SHAgHBs com 226 aaLHAgHBs com 345 aaMHAgHBs com 281 aa Codificadas pelo gene S do genoma viral SS-pré-S1/pré-S2S/pré-S1 REGIÕES Região hidrofílica globular: aas 99 a 169 do SHAgHBs DETERMINANTE ANTIGÊNICO a aas 121 – 149 da região S

45 Determinante Antigênico a É comum a todos os sub-tipos do HBV Tem afinidade com o determinante a –Acs contra o AgHBs na infecção pelo HBV –Acs após a vacinação –Acs das gamaglobulinas específicas policlonais (HBIg) –Acs dos kits diagnósticos para a detecção de AgHBs

46 Principais Mutações do HBV No determinante antigênico a –Gly (145) substituída por arg –Lys (141) substituída por glu –Vacina, HBIG e diagnóstico escape G145R, K141E (Alça 2 determinante a)G145R, K141E (Alça 2 determinante a) T126S, T131N (Alça 1 determinante a)T126S, T131N (Alça 1 determinante a) –G145R Descrita mais frequentemente em pacientes vacinados, mas também em portadores crônicos não vacinadosDescrita mais frequentemente em pacientes vacinados, mas também em portadores crônicos não vacinados

47 G D E D 164 R E F Y 158 s-s- -s-s- --s--s- M I 195 S W M I Alça 1do determinante a Alça 2 do determinante a (Carman, W. J Viral Hepatitis : 11-20) Vaccine Escape Mutants: T126S T131N M133L K141E D144E G145R N144R Thr143Leu Ser 143Leu G130N res à lamivudina

48 Mutações do AgHBs Diagnóstico de HBV em indivíduos AgHBs negativos –Importância dos Ac monoclonais / policlonais Falha na vacinação de recém nascidos de mães Ag HBs positivas (0,6 – 4,0%) Falha na imuno profilaxia em receptores de transplante ortotópico de fígado (11 -66%) Falhas no tratamento com antivirais

49 BRASIL –Testes obrigatórios na triagem sorológica de doadores de sangue Anti-HIV1/2 (2) Anti-HTLVI/II (1) Anti-HCV (1) Ag HBs (1) Anti-HBc (1) Sífilis (1) Chagas (2) ALT (1) Anti-HIV1/2 (2) Anti-HTLVI/II (1) Anti-HCV (1) Ag HBs (1) Anti-HBc (1) Sífilis (1) Chagas (1) –ELISA Alta sensibilidade Nº Nov / 93 Nº Out / 96 Nº 488 / 98 RDC Nº 343 Dez / 2002 RDC Nº 153 Junho / 2004

50 Testes para detecção do AgHBs Sensibilidade Especificidade Detecção de mutantes

51 Sensibilidade clínica de 17 kits com marca CE, frente a diversos painéis de soro-conversão Sheiblauer H,Soboll H and Nick S. J. Med. Virol. 78:S66-S70, 2006

52 Sensibilidade analítica de 7 kits para AgHBs. Dados recentes da literatura: 1-Ly TD et al, J. Clin. Microbiol 2006; 44(7): Ly TD et al. J. Med. Virol. 2007; 79:S37-S41.

53 Ensaio Direto Sandwich: Detecção de AgHBs (ELISA) HRP H 2 O 2 /TMB Positivo H 2 SO 4 Fase sólida Ag HBs Ac Monoclonais (mistura) Ac monoclonais Ac policlonais

54 Anticorpos Policlonais: Reconhecem múltiplos sítios de ligação do Ag Monoclonais: Reconhecem um único sítio de ligação do Ag Ag Ac Policlonais Ac Monoclonais

55 Sensibilidade de acordo com o tipo de anticorpos utilizados em kits AgHBs Anticorpos na Fase sólida Anticorpos do conjugado Sensibilidade 1 anticorpo monoclonal 1 anticorpo monoclonal ~ 1,5 ng/mL Anticorpos policlonais 2 anticorpos monoclonais 0,3-0,5 ng/mL 3 anticorpos monoclonais Anticorpos policlonais < 0,15 ng/mL

56 Triagem Sorológica de Doadores de Sangue para o HBV Na seleção dos testes para AgHBs, dar preferência: –Aos que apresentem melhor sensibilidade Detecção <0,1 ng de AgHBs /mL –Aos que consigam detectar o maior número de mutantes

57 Teste rápido para Ag HBs VIKIA - bioMérieux

58 Ensaios para HBV DNA Digene Corp. Roche Molecular Systems Bayer Corp HBV DNA IU/mL HBV Digene Hybrid-Capture I HBV Digene Hybrid-Capture II Ultra-Sensitive Digene Hybrid-Capture II Amplicor HBV Monitor Cobas Amplicor HBV Monitor Versant HBV DNA 1.0 Versant HBV DNA 3.0 Cobas Taqman 48 HBV Real Art HBV PCR Assay Artus-Biotech Locarnini S, 2005 WHO International Standar 1UI/ml = 5-6 cópias/mL

59 Importância do anti-HBc Diagnóstico –Anti-HBc (IgM / IgG) Triagem sorológica –Anti-HBc IgG (total) Sensibilidade Especificidade

60 Hepatites pós - Transfusionais HBsAg Exclusão de doadores com fatores de Risco p/ HIV Anti-HIV ALT/Anti-HBc Anti-HCV Testes HCV melhorados Adaptado de HJ Alter and Tobler and Busch, Clin Chem 1997

61 : Reconhece-se que cerca de 90% de todas as hepatites transmitidas por transfusão eram não-A, não-B. (NANB). 1965: Descoberto o Antígeno Australia (AgHBs) : Triagem por Anti-HBc e ALT surrogate tests para HNANB 1990: Início da Triagem para anti-HCV (1ª G) 1991: Triagem por Anti-HBc recomendada pela FDA para reduzir a incidência de hepatite B transmitida por transfusão 1995: NIH/NHLBI Concensus Development Conference recomenda que o teste ALT seja descontinuado; Mantem-se o teste anti-HBc para evitar o risco residual de transmissão do HBV AgHBs + Anti-HBc AÇÕES PARA EVITAR AS HEPATITES PÓS-TRANSFUSIONAIS Testes AgHBs 3 ª geração aplicados na triagem

62 2 e 3: Portadores. (3 = alta infectividade) 4 e 5: Hepatite B oculta. (DNA em baixas concentrações: <10 3 UI/mL) 6 e 7: Exposto ao HBV? Imune? Anti-HBs? Infectante? Marcadores da Infecção pelo HBV Perfis observados na triagem de doadores 8: Recuperação sorológica

63 Sensibilidade analítica e Especificidade de alguns kits anti-HBc (total) Testes Anti-HBc MarcasSensibilidade (PEI/mL)Especificidade (%) bioMérieux 0,799,85 Dia Sorin <0,599,83 Dade Behring -99,7 Wiener -99,4 BioKit 1,5- Bio Rad 0,699,

64 Ensaio Competitivo NEGATIVO H 2 O 2 /TMB H 2 SO 4 HRP Anti-HBc Total Fase sólida AgHBc Soro

65 HRP H 2 O 2 /TMB Positivo H 2 SO 4 Ensaio Indireto: IgG Fase sólida Ag Soro

66 Ensaio Direto Sandwich: IgG Positivo H 2 SO 4 HRP H 2 O 2 /TMB Fase sólida Anti-HBs

67 Falhas na detecção do Anti-HBc Avettand-Fenoel V, et al. J. Clin. Microbiol amostras de soro, AgHBs (+) [hepatite crônica p/ HBV] Anti-HBc Positivo Negativo 39 (1,79%) 26 (66,6%) +/- com kits diferentes 13 (33,3%) Sempre Neg Apenas 3 mutações HIV (+) = 13 Transplantados = 5 -Pacientes altamente imunocomprometidos -Falta de sensibilidade de alguns kits

68 Tipos de Testes ELISA utilizados para a triagem de doadores de sangue no Brasil

69 RFP e RFN (%) para a triagem por anti-HBc, observados nos PCQES* desenvolvidos para Bancos de Sangue no Brasil (2006 – 2007) (*) Programas de Controle de Qualidade Externo em Sorologia

70 Importância do Anti-HBc na triagem sorológica de doadores de sangue Eliminar o risco residual de transmissão do HBV por transfusão Testes AgHBs com baixa sensibilidade Níveis de AgHBs indetectáveis Mutantes no determinante a do HBV Hepatite B oculta

71 Dados da Triagem sorológica para anti-HBc em Regiões de média prevalência para o AgHBs Países AgHBs (neg) Anti-HBc (pos) Paquistão17,28% Grécia14,95% Índia10,82%

72 Triagem sorológica pelo anti-HBc Bhatti FA et al. Transfusion 2007 Paquistão - Transfusão de unidades de sangue: 1,5 milhões de unidades transfundidas anualmente Prevalência de AgHBs (+) em doadores: 2,16% O anti-HBc não é usado na triagem de doadores Estudo do anti-HBc em 966 doadores mostrou: 185 (19%) foram anti-HBc (+) 167 (17,28%) eram AgHBs (-) e anti-HBc (+) Desses 167, 76% eram anti-HBs (+) HBV-DNA foi detectado em 5 doadores que eram AgHBs (-) e anti-HBc (+). Infecção oculta pelo HBV 1 em cada 200 doadores AgHBs negativos ainda poderiam transmitir HBV para os receptores

73 % de Bolsas descartadas na Triagem Sorológica de Doadores de Sangue, por Macroregião – Brasil, Dados HEMOPROD / ANVISA / MS NorteNordesteSudesteCentro Oeste SulBrasil AgHBs0,60,770,420,430,460,52 Anti- HBc 8,124,292,914,954,924,2 Anti- HCV 0,620,690,470,350,380,51 Anti- HIV 0,460,90,390,410,270,49

74 Importância do Anti-HBc na triagem sorológica de doadores de sangue Em regiões de baixa prevalência Descarte de 2 a 5% Em regiões de média e alta prevalência para o AgHBs O descarte pode atingir mais de 20% Em regiões com baixa prevalência para o AgHBs, mas onde ocorra intensa transmissão horizontal em crianças, o descarte por anti-HBc em doadores pode chegar aos 10%

75 Alternativas em Regiões com Alta Prevalência de Anti-HBc (+) Conseguir um pool de doadores negativos para AgHBs e Anti-HBc e motivá-los a doar sangue regularmente Vacinar os doadores com apenas anti-HBc (+) e verificar a soroconversão Importar unidades de sangue de regiões com baixa prevalência de Anti-HBc

76 Alternativas em Regiões com Alta Prevalência de Anti-HBc (+) Doadores anti-HBc (+) com anti-HBs >100 mUI/mL, Poderiam ser aceitos Doadores anti-HBc (+) com anti-HBs < 100 mUI/mL, só seriam aceitos se fossem HBV-DNA Negativos Aproveitar doadores anti-HBc (+) Controverso, porque a presença de anti-HBs nem sempre é indicativa da ausência de HBV - DNA

77 Alternativas em Regiões com Alta Prevalência de Anti-HBc (+) Um estudo no Irã com doadores mostrou a presênça de Anti-HBc (+) em 131 (6,55%) sendo que 16 dos 131 (12,2%) eram HBV – DNA (+) Se o anti-HBc é (+) a bolsa de sangue deverá ser Descartada Posteriormente o teste para HBV-DNA pode ser adequado para seguimento da infecção por HBV Behzad-Behbahani A. J. Med. Res Arraes LC et al. Rev. Inst. Med. Trop. S.Paulo 2003 Yotsuyanagi H et al. Transfusion, 2001

78 Reatividade de mutantes r-HBsAg, em vários ensaios AgHBs

79 Comportamento dos testes para detecção de AgHBs na presença de mutantes do antígeno de superfície do HBV Emerging Infectious Diseases Vol. 12, No. 2, February 2006 Coleman PF

80 Desempenho de kits AgHBs para a detecção de mutantes Thr126-Ser Gln129-His Met133-Leu Asp144-Ala Gly145-Arg Thr126-Ser + Gly145-Arg Pro142=Leu + Gly145-Arg Pro142-Ser + Gly145-Arg Asp144-Ala + Gly145=Arg N = 212 amostras 107 AgHBs Negativas 105 AgHBs Positivas Painel de referência com amostras de doadores de sangue - Tailândia Painel de mutantes AgHBs rec Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B Virus mutation within a determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1):

81 Desempenho de diversos kits AgHBs frente a um painel de referência de doadores de sangue na Tailândia Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B Virus mutation within a determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1):

82 Kits AgHBs usados no estudo Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B Virus mutation within a determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1): Ab: Mono/poliAb: Mono/mono MEIA: microbead enzyme-linked immunoassay; ELFA: enzyme-linked fluorescent assay; EIA: enzyme-linked immunosorbent assay; ECLIA: electrochemiluminescence-linked immunoassay; ECI: enhanced chemiluminescence immunoassay.

83 Desempenho de diversos kits AgHBs frente a um painel de Mutantes AgHBs rec Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B Virus mutation within a determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1):

84 Desempenho de kits AgHBs para a detecção de mutantes Roche Mutant Panel (Recombinant) Sheiblauer H,Soboll H and Nick S. J. Med. Virol. 78:S66-S70, 2006 Cut-off of ARCHITECT assay = 0,05 IU/mL

85 Desempenho de kits AgHBs para a detecção de mutantes ABBOTT Coleman Panel Sheiblauer H,Soboll H and Nick S. J. Med. Virol. 78:S66-S70, 2006

86 Natural Mutant Panel Desempenho de Kits Ag HBs para a Detecção de Mutantes Sheiblauer H,Soboll H and Nick S. J. Med. Virol. 78:S66-S70, 2006

87 Thoai Duong Ly et al. J. Clin. Microbiol, july 2006 Sensitivities of four New commercial hepatitis B surface antigen (HBsAg) assays in detection of HBsAg mutant forms. Thoai Duong Ly et al. J. Clin. Microbiol, july 2006

88

89 (Ly TD. J. Med. Virol. 2007; 79:S37-S41) Desempenho de Kits Ag HBs na Detecção de Mutantes (Ly TD. J. Med. Virol. 2007; 79:S37-S41) Reactive S/CO: AxSYM = 2; Architect = 0,05 IU/ml; Liaison = 1,1; Vidas ultra = 0,13; los demás = 1

90 Janela Imunológica do HBV Janela imunológica VírusTestes ELISA NAT HBV 56 dias dias HBV 56 dias 45 (34-66) dias Risco residual de transmissão por transfusão 1: a

91 NAT para HBV na Triagem de doadores de sangue NAT para HBV Doações Doações NAT-HBV (+), AgHBs (-) 10 Rendimento período de janela 1/ Rendimento Infecções HBV ocultas 39 (1/42.100) Sociedade Espanhola de Transfusão Sanguínea, 2007

92 O HDV precisa da presença do HBV para causar infecção. Distribuição heterogênea ao redor do mundo. Endêmico em algumas regiões da América Latina, Europa e África. Pode estar associado a formas graves de hepatites em algumas regiões do Norte da América do Sul. Vírus da Hepatite Delta (HDV)

93

94 Marcadores sorológicos da Hepatite por Vírus Delta Anti-VHD (IgM) –Fase aguda Anti-VHD (IgG) –Recuperação AgVHD –Fase aguda

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96

97 Diagnóstico da infecção por HDV AgHBs Anti-HBc IgM Anti-HDV IgM Anti-HDV Total Interpretação +++ Coinfecção + Neg + Super infecção ++/-+/- Neg + Infecção passada ++/-+/- Neg Ausência de infecção

98 Hepatite por Vírus C (HCV) A infecção pelo HCV representa um dos mais graves problemas de saúde pública no Brasil e no mundo. 170 milhões de pessoas infectadas pelo HCV, no mundo. Indivíduos infectados pelo HCV –Hepatite crônica (80% - 85%) Cirrose hepática (20%) –HCC (10% - 20%)

99 História Natural da Hepatite C crônica (50 anos) Hoofnagle JH, Hepatology 36(5), 2002

100 Prevalência de infecção pelo HCV em doadores de sangue CDC *Anti-HCV defined by EIA and supplemental testing

101 Transmissão do HCV A principal via: parenteral –Entre usuários de drogas intravenosas –Por agulhas e seringas Esterilização inadequada ou reutilização –Transfusão Sangüínea –Transplante de órgãos Vertical Sexual (ineficiente) Ocupacional

102 Teste para HCV recomendado em: Usuários de drogas ilícitas injetáveis Quem recebeu fatores de coagulação antes de 1987 Quem recebeu hemocomponentes ou órgãos antes de 1992 Pacientes submetidos a hemodiálise Evidência de doença hepática Profissionais da área da saúde (com suspeita de exposição a sangue contaminado com HCV) Crianças nascidas de mães HCV positivas

103 Recomendações após exposição ao HCV Seguimento após picadas de agulhas, cortes ou exposição de mucosas a sangue HCV positivo –Testar a fonte de contaminação p/ HCV –Testar a pessoa exposta, se a fonte for (+) –Anti-HCV e ALT, imediato e até 4-6 meses –HCV-RNA em 4-6 semanas (+ rápido) –Confirmar todos os anti-HCV com IB Encaminhar a pessoa infectada a serviço médico especializado para avaliação e seguimento CDC

104 Risco de infecção após picada com agulha usada em paciente infectado VírusRisco HBV30% HCV3% HIV0.3%

105 Padrão Sorológico na Infecção aguda por HCV com Recuperação ALT Normal Mod. CDC, 2002 Tempo após a Infecção Título anti-HCV Anos Meses HCV - RNA

106 HCV - Evolução para Infecção Crônica Tempo após a infecção Título anti-HCV ALT Normal Anos Meses HCV RNA

107 Evolução do HCV-RNA, Ag HCV e anti-HCV EvoluçãoPara a cura Evolução Para a cronicidade

108 Detecção da infecção pelo HCV Testes Laboratoriais Indiretos –Pesquisam a presença de anticorpos contra o HCV Diretos –Testes de biologia molecular para pesquisa do RNA – HCV –Pesquisam a presença do Ag core do HCV Combinação –Pesquisam a presença de anticorpos contra o HCV e do Ag core do HCV

109 Estrutura do RNA - HCV C Estrutura EstruturalNão-Estrutural estruturaprocessamentoreplicação -----estrutura processamento replicação E1E2NS2NS4BNS5ANS5BNS3 NS4A Fosfoproteína replicação RNA dependente RNA polimerase NS3 cofator Replicação ? Serina protease Helicase Proteínas do envelope Reunião e entrada Nucleocapsídeo 1ª geração 2ª geração 3ª geração ELISA C Protease

110 Testes Laboratoriais – HCV ELISA –1ª Geração – NS4 –2ª Geração – Core+NS3+NS4 –3ª Geração – Core+NS3+NS4+NS5 Ac IgG + IgM Variantes virais da NS3 –4ª Geração – Ag / Ac

111 Testes Laboratoriais - HCV ELISAELISA MEIAMEIA Quimioluminescência (CLIA)Quimioluminescência (CLIA) Aglutinação de partículas de gelatinaAglutinação de partículas de gelatina Imuno blotImuno blot Testes rápidosTestes rápidos

112 Imunoblot – RIBA HCV 3.0 Positivo Indeterminado Negativo Interpretação Controle IgG Nível II Controle IgG Nível I c100(p) 5-1-1(p) c33cc22 (p)NS5hSOD

113 Amostras Repetidamente Reagentes

114 Avaliação de Kits anti-HCV - ELISA Kit A Kit B Kit C Sensibilidade 100% Especificidade Triagem 99,4%98,6%97,9% Sensibilidade Especificidade Triagem + painel de soros (-) e Heterólogos 100% 99,4% 98,2% 98,6% 100% 97,9% Sáez-Alquezar A et al. Laes & Haes 169: 90-94, 2006

115 Ensaios para a detecção do RNA - HCV Testes qualitativos –Limite inferior de detecção: 10 – 50 UI/mL Testes quantitativos* –Valor de corte para quantificação do RNA Limite inferior: ~ 600 UI/mL Limite linear superior : – UI/mL (*): Amplificação do alvo (PCR ou TMA ou amplificação do sinal (branched ) A OMS padronizou as unidades de quantificação do RNA-HCV em UI/mL Exemplos de fatores de conversão Cobas Amplicor HCV Monitor. V2,9: 1 UI/mL = 2,7 cópias/ml Versant HCV RNA Quantitative assay: 1 UI/ml = 5,2 cópias/ml

116 Positivo Negativo PCR

117 Nomenclatura dos Diferentes Genótipos do Vírus da Hepatite C GenótiposSubtipos 11a, 1b, 1c 22a, 2b, 2c 33a, 3b, 3c 44a 55a 66a Stuyver & Simmonds

118 Genotipagem do HCV INNO - LIPA RFLP Restriction fragment Lenghtpolymorphism Seqüênciameneto de porções variáveis do genoma

119 Distribuição dos diferentes genótipos do HCV em diferentes regiões Genótipos 1, 2 e 3. –Países Ocidentais, Oriente Próximo Genótipos 5 e 6. –África do Sul, Sudeste da Ásia Genótipo 4. –Oriente Médio, África Central, Brasil

120 Prevalência dos genótipos do HCV São Paulo – Brasil (N=348) Genótipos Doadores de sangue (%)Hemofílicos(%) Transplante renal (%) Hepatite crônica C (%) Total(%)1 2,94,375,05,212,9 1a 17,634,8-20,318,7 1b 38,217,4-36,631,3 2 5,913,05,03,24,3 3 32,430,415,033,931,3 4a 002,500,3 Mix 2,902,50,81,1 Bassit L et al. Rev. Inst. Méd. Trop. São Paulo. v. 41 (3): 183 – 189, May – June, Bassit L et al. Hepatology Vol. 29 (3): 994 – 95,

121 Considerações Sobre o uso de Testes ELISA anti-HCV Pacientes imunocompetentes Pacientes imunocomprometidos ou em Hemodiálise Pacientes com Hepatite Crônica Populações de alto risco Populações de baixa prevalência Doadores de sangue

122 Hemoterapia Importância da Triagem Sorológica em Doadores de Sangue –Usar testes que diminuam o período da janela imunológica Anti-HCV Combo Ag/Ac Ag NAT (mini pool – amostras individuais)

123 Janela imunológica na infecção pelo HCV com os marcadores utilizados Janela imunológica InfecçãoNAT Ag EIA 3ª EIA 2ª EIA 1ª DIAS Ag/Ac

124 Alan Kitchen

125 Example of a representative profile HCV Seroconversion Panel BBI 917 :

126 HCV-Ag/Ac Redução da Janela Imunológica Ranking on 35 Seroconversion panels, including subtype 1a, 1b, 2b, 3a in average days of delay for detection versus NAT : HCV Ultra detects exposure to HCV with a minimum of 17 days earlier than anti-HCV Ab assays tested : 70 % reduction of the serologic HCV WP

127 Desempenho do HCV-Ag/Ac frente a diferentes Genótipos A total of 405 genotyped samples were tested : 133 genotypes from various origin 272 genotypes from 2 hospital laboratories All these samples from different genotypes were found positive : 100 % sensitivity (405 / 405) Bio-Rad

128 Janela Imunológica dos vírus HBV, HCV e HIV Janela imunológica VírusTestes ELISAAg / AcNAT HBV 56 dias dias HCV70 dias25-39 dias ?23 dias HIV 22 dias dias 11 dias

129 Fase inicial da infecção pelo HCV Eclipse

130 Retrovirus Epidemiology Donor Study [REDS] group Busch MP. Transfusion 2006; 46:

131 Bianco C.

132 Janela Imunológica com os testes diagnósticos para a infecção por HCV Anti-HCV 1ª G 150 dias Anti-HCV 2ª G 82 dias Anti-HCV 3ª G 66 dias dias Combo Ag/Ac 12,5 dias* 39,2 dias** 38 dias menos que o anti-HCV NAT 7.4 dias* 31.9 dias** 8 – 9 dias (*)Buch M et al. Transfusion 2005, 45: (**) Laperche S et al. Transfusion :

133 Muito Obrigado


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