Diagnóstico Laboratorial das Hepatites A, B e C

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1 Diagnóstico Laboratorial das Hepatites A, B e C
Amadeo Sáez-Alquézar Vitória 2008

2 Hepatites por Vírus Até 1965
Hepatite Infecciosa A Curto período de incubação Hepatite por soro homólogo B Longo período de incubação

3 Hepatites Virais Hepatite por vírus A HAV Hepatite por vírus B HBV
Hepatite por vírus C HCV Hepatite por vírus D HDV Hepatite por vírus E HEV Hepatites Não A-E HGV.. Vírus Epstein Bar, Citomegalovírus, Herpes, outros

4 Hepatites Virais Mais Frequêntes
VÍRUS Família A Picornaviridae B Hepadnaviridae C Flaviviridae D Deltaviridae E Caliciviridae

5 Características das Hepatites

6 Hepatites Não A-E Vírus da Hepatite G ou GB-C
Agente etiológico HGV TTV Família flavivirus circovirus Genôma RNA DNA Tamanho (nm) 50 – 100 30 – 50 Envelope SIM NÃO Marcadores HGV – RNA Anti-E2 TTV – DNA Transmissão Parenteral

7 Diagnóstico das Hepatites por Vírus
Testes sorológicos. Marcadores sorológicos (Ac, Ag). Testes de biologia molecular. Amplificação de ácidos nucléicos. Testes bioquímicos. Enzimas, pigmentos biliares, proteínas.

8 HAV e HEV Distribuição mundial Transmissão entérica (fecal-oral)
Não apresentam formas crônicas Hepatite aguda grave: HAV Crianças < 1%; adultos >2% HEV:em gestantes 15 – 25%

9 HAV: Prevenção da Infecção
Melhoria dos Padrões Sócio-econômicos e de Higiene. Em áreas endêmicas para HAV: A vacinação de crianças é mandatoria. A imunogenicidade da vacina para hepatite A é muito alta, obtendo-se 97% a 100% de soro conversão após uma única dose e de 100% com a segunda dose. Vacinar viajantes de áreas não endêmicas para áreas endêmicas. Vacinas: Havrix® e Vaqta®

10 Transmissão da HVA Por contato pessoal
Doméstico, sexual, crianças em locais de estudo e recreação. Por água e alimentos contaminados. Pelo sangue (rara) Uso de drogas endovenosas. Transfusão sangüínea

11 HVA - Características Clínicas
Período de incubação: 30 (15-50) dias Icterícia por faixa etária < 6 anos: < 10% 6 a 14 anos: – 50% > 14 anos: – 80% Complicações: raras Formas crônicas: ausentes

12 Distribuição geográfica da infecção pelo vírus da Hepatite A
CDC

13 HAV Estrutura e variabilidade genética
Estrutura icosahédrica Não envelopado Genoma: fita única de RNA 7500 nucleotídeos (3 regiões) Região codificadora (P1 – P2 – P3) 4 proteínas virais: VP1, VP2, VP3 e VP4 Três Genótipos (15% de variações no VP1) Um único sorotipo P2: Proteínas nâo estruturais (2A, 2B e 2C) P3: Proteinas estruturais (3A, 3B, 3C e 3D)

14 Marcadores Sorológicos da Hepatite por Vírus A
Anti-VHA (IgM) Anticorpos contra o VHA, subclasse IgM FASE AGUDA Anti-VHA (IgG) Anticorpos contra o VHA, subclasse IgG RECUPERAÇÃO - IMUNIDADE

15 VHA Nas fezes Viremia

16 Imuno Captura : IgM reverso
anti-HAV (IgM), anti-HBc (IgM), anti-Delta (IgM) H2O2/TMB HRP AgHAV H2SO4 Positivo Fase sólida

17 HVE Características Clínicas
Paraná R & Schinoni MI Período de incubação:: 40 (15 – 60) dias Formas graves: 1% - 3% Gestantes: % - 25% Gravidade: aumenta com a idade Formas crônicas:: não identificadas.

18 HEV – Características epidemiológicas
A maioria dos surtos estão associados à ingestão de água contaminada com fezes. A transmissão, pessoa a pessoa, é mínima. Frequêntemente descrita em viajantes para áreas endêmicas.

19 Distribuição geográfica da infecção pelo vírus da Hepatite E
CDC Surtos de infecção confirmada em > 25% de hepatites esporádicas Não ABC

20 Marcadores Sorológicos para o Vírus da Hepatite E
Anti-HEV IgM Fase aguda Diagnóstico Anti-HEV IgG Recuperação Prevalência

21 Prevalência de infecção por HEV e HAV - Rio de Janeiro
Grupos Anti-HEV (IgG) (%) Anti-HAV (IgG) Doadores de sangue (93) 4,3 92,5 Gestantes (304) 1,0 84,5 Área urbana (260) 31,2 Área rural (145) 2,1 79 Hemodiálise (65) 6,2 91 Usuários de drogas IV (102) 11,8 80,4 TRINTA, Karen S, LIBERTO, Maria Isabel M, PAULA, Vanessa S de et al. Hepatitis E virus infection in selected Brazilian populations. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Jan. 2001, vol.96, no.1, p

22 Infecção pelo HBV A prevalência da infecção por HBV, no mundo, é estimada em torno de 4 – 5% da população total do planeta. Portadores crônicos assintomáticos Hepatite crônica (350 milhões) Carcinoma Hepatocelular (HCC) Estima-se que ocorrem 50 milhões de novos casos, por ano, de infecção pelo HBV.

23 Distribuição Mundial da Infecção Crônica por HBV
HBsAg Prevalência 8% - Alta 2-7% - Intermediária <2% - Baixa CDC

24 Formas de Transmissão do HBV
Exposição per cutânea e de mucosas a fluídos corporais contaminados. Contato sexual Transfusão sangüínea Transplante de órgãos Vertical (mãe p/ o recém nascido) Uso de agulhas e seringas contaminadas Acidentes em laboratório

25 Infecção pelo HBV Adultos Crianças Hepato carcinoma Cirrose
crônica Cirrose Hepato carcinoma Falência hepática Transplante ou óbito 30% 5% a 10% 23% Em 5 anos 80% Assintomática 20% Doença Aguda >1% Hepatite Fulminante Crianças Quase sempre Sub-clínica

26 Infecção Crônica por HBV
Risco para desenvolver infecção crônica Desenvolver HCC Período perinatal > 90% 25% Crianças 1 a 5 anos 25 – 50% Crianças (>5) Adultos 6 – 10% 15%

27 HBV - PREVENÇÃO Imunização passiva Imunização ativa Imuno globulina
Proteção curta (2 – 3 meses) Imunização ativa Vacina Proteção longa (anos) Plasma purificado (1981) Vacina recombinante (1986)

28 VACINA HBV Esquema Eficacia Proteção (> 15 anos)
Três doses (0-1-6 meses) Não é necessário reiniciar, se passou o tempo estabelecido entre as doses. Eficacia Resposta adequada: anti-HBs > 10UI/ml Proteção (> 15 anos) 1ª dose: 30-50% - 2ª dose: 75% - 3ª dose: 96% Menor em imunodeprimidos e idosos

29 Vírus da Hepatite B

30 Marcadores sorológicos da Hepatite por Vírus B
AgHBs Anti-HBs AgHBe Anti-HBe Anti-HBc (IgM) Anti-HBc (IgG ou total)

31 HBV-DNA

32

33 Perfis Sorológicos Observados em Indivíduos Infectados pelo HBV
Perfil Ag HBs Anti-HBc IgM Anti-HBc IgG Anti-HBs 1 + - 2 3 4 5 6 7 8

34 Interpretações para o anti-HBc (+) com AgHBs/anti-HBs (-)
1-Resultado falso positivo para o anti-HBc. Mais de 66% dos indivíduos com AgHBs negativo, anti-HBc positivo e anti-HBs negativo, quando submetidos à vacinação contra o HBV soroconvertem, com positividade para o anti-HBs, o que indicaria que o anti-HBc isolado correspondia a um resultado falso positivo. 2-Infecção passada pelo HBV e que após algum tempo desapareceu o anti-HBs. 3-O AgHBs está en níveis muito baixos, ou se encontra formando imunocomplexos com o anti-HBs, de modo que não pode ser detectado. 4-Mutantes AgHBs. Ainda que as provas para detecção do AgHBs apresentem alta sensibilidade, alguns testes podem não detectar mutantes.

35 HBV – DNA circular de hélice dupla parcialmente fechada e envelope lipídico
4 Regiões abertas para leitura S P C X Genoma: nucleotídeos

36 GENOMA DO HBV Pré S1 Pré S2 gene S gene P gene C Pré C AgHBs
DNA Polimerase gene P AgHBc AgHBe gene C Pré C

37 HBV: Replicação e Variantes
Replica seu genoma (DNA) via transcrição reversa do RNA pré-geonómico Inserção incorreta de nucleotídeos no cDNA Geração de “quasiespécies” Alta replicação viral: por dia Alta taxa de mutações

38 HBV – AgHBs – Variantes Subtipos Genótipos Mutantes
O AgHBs possui diversas proteínas Determinantes antigênicos (a, d, y, w, r) Combinações: subtipos Mais comuns: adw, adr, ayw. O determinante antigênico “a” é comum a todos os subtipos Genótipos Baseados na divergência genética de 8%, ou mais, da sequência completa de nucleotídeos Genótipos: A, B, C, D, E, F, G, H Mutantes

39 A F E D C B Ba Distribuição Geográfica Genótipos do HBV Genótipos A B
B/C Ba Bj A F E D C B G H Ba Bj Baseados na divergência genética de 8% ou mais da sequência completa de nucleotídeos Stuyver et al., J Gen Virol. 2000;81(1): deMan et al., J Hepatol. 1998;29(4):

40 Variantes do HBV Os subtipos e genótipos do HBV se originam de forma natural durante o curso da infecção pelo HBV Consolidadas na natureza Apresentam distribuição étnica e geográfica características

41 Mutantes do HBV Gerados espontaneamente durante o curso da infecção natural pelo HBV Gerados num ambiente de pressão seletiva Uso de imuno profilaxia ativa Uso de imuno profilaxia passiva Tratamento com anti-virais

42 Principais Mutantes do HBV
Mutantes pré-Core ou Core promoter Achados em cepas mais virulentas Mutantes no gene P (polimerase) Resistência a anti-virais Mutantes no gene X Associados ao desenvolvimento de hepatocarcinoma Mutantes no gene S Modificam os epítopos imunodominantes do determinante antigênico “a”

43 Principais Mutações do HBV
Na região pré core do DNA-HBV (mutantes de escape do AgHBe) Falha na expressão do AgHBe a partir da região Pré-Core Ex: aa gly, substituído pelo aa arg [PCR DNA-HBV (+) e AgHBe (-)] Resistência aos anti-virais Mutações na Polimerase Lamivudina Adefovir

44 Estrutura antigênica do AgHBs
O envelope do HBV contem 3 proteínas (complexo AgHBs) SHAgHBs com 226 aa LHAgHBs com 345 aa MHAgHBs com 281 aa Codificadas pelo gene S do genoma viral REGIÕES S S-pré-S1/pré-S2 S/pré-S1 Região hidrofílica globular: aas 99 a 169 do SHAgHBs DETERMINANTE ANTIGÊNICO “a” aas 121 – 149 da região S

45 Determinante Antigênico “a”
É comum a todos os sub-tipos do HBV Tem afinidade com o determinante “a” Acs contra o AgHBs na infecção pelo HBV Acs após a vacinação Acs das gamaglobulinas específicas policlonais (HBIg) Acs dos kits diagnósticos para a detecção de AgHBs

46 Principais Mutações do HBV
No determinante antigênico “a” Gly (145) substituída por arg Lys (141) substituída por glu Vacina, HBIG e diagnóstico “escape” G145R, K141E (Alça 2 “determinante a”) T126S, T131N (Alça 1 “determinante a”) G145R Descrita mais frequentemente em pacientes vacinados, mas também em portadores crônicos não vacinados

47 Alça 1do determinante “a” s-s- 126 T126S T131N M133L K141E D144E G145R
121 s-s- 124 126 Vaccine Escape Mutants: T126S T131N M133L K141E D144E G145R N144R Thr143Leu Ser 143Leu Y 158 131 F 99 133 G130N res à lamivudina 137 --s--s- 149 164 107 -s-s- E 138 139 s-s- D 147 145 141 195 144 G R D I M E W S M 196 Alça 2 do determinante “a” 210 198 (Carman, W. J Viral Hepatitis : 11-20) I

48 Mutações do AgHBs Diagnóstico de HBV em indivíduos AgHBs negativos
Importância dos Ac monoclonais / policlonais Falha na vacinação de recém nascidos de mães Ag HBs positivas (0,6 – 4,0%) Falha na imuno profilaxia em receptores de transplante ortotópico de fígado (11 -66%) Falhas no tratamento com antivirais

49 BRASIL –Testes obrigatórios na triagem sorológica de doadores de sangue
Anti-HIV1/ (2) Anti-HTLVI/II (1) Anti-HCV (1) Ag HBs (1) Anti-HBc (1) Sífilis (1) Chagas (2) ALT (1) Anti-HIV1/ (2) Anti-HTLVI/II (1) Anti-HCV (1) Ag HBs (1) Anti-HBc (1) Sífilis (1) Chagas (1) ELISA Alta sensibilidade Nº Nov / 93 Nº Out / 96 Nº 488 / 98 RDC Nº 343 Dez / 2002 RDC Nº 153 Junho / 2004

50 Testes para detecção do AgHBs
Sensibilidade Especificidade Detecção de mutantes

51 Sensibilidade clínica de 17 kits com marca CE, frente a diversos painéis de soro-conversão
Sheiblauer H,Soboll H and Nick S. J. Med. Virol. 78:S66-S70, 2006

52 Sensibilidade analítica de 7 kits para AgHBs
Sensibilidade analítica de 7 kits para AgHBs. Dados recentes da literatura: 1-Ly TD et al, J. Clin. Microbiol 2006; 44(7): Ly TD et al. J. Med. Virol. 2007; 79:S37-S41.

53 Ensaio Direto “Sandwich”: Detecção de AgHBs (ELISA)
Ac Monoclonais (mistura) H2O2/TMB Positivo H2SO4 HRP Fase sólida Ac monoclonais Ac policlonais Ag HBs

54 Anticorpos Policlonais: Reconhecem múltiplos sítios de ligação do Ag Monoclonais: Reconhecem um único sítio de ligação do Ag Ag Ag Ac Policlonais Ag Ag Ac Monoclonais

55 Sensibilidade de acordo com o tipo de anticorpos utilizados em kits AgHBs
Anticorpos na Fase sólida Anticorpos do conjugado Sensibilidade 1 anticorpo monoclonal ~ 1,5 ng/mL Anticorpos policlonais 2 anticorpos monoclonais 0,3-0,5 ng/mL 3 anticorpos < 0,15 ng/mL

56 Triagem Sorológica de Doadores de Sangue para o HBV
Na seleção dos testes para AgHBs, dar preferência: Aos que apresentem melhor sensibilidade Detecção <0,1 ng de AgHBs /mL Aos que consigam detectar o maior número de mutantes

57 Teste rápido para Ag HBs VIKIA - bioMérieux

58 Roche Molecular Systems
Ensaios para HBV DNA HBV Digene Hybrid-Capture I Digene Corp. HBV Digene Hybrid-Capture II Ultra-Sensitive Digene Hybrid-Capture II Amplicor HBV Monitor Roche Molecular Systems Cobas Amplicor HBV Monitor Cobas Taqman 48 HBV Artus-Biotech Real Art HBV PCR Assay Versant HBV DNA 1.0 Bayer Corp. Versant HBV DNA 3.0 WHO International Standar 1UI/ml = 5-6 cópias/mL 102 104 103 105 106 107 108 1010 109 10 1 HBV DNA IU/mL Locarnini S, 2005

59 Importância do anti-HBc
Diagnóstico Anti-HBc (IgM / IgG) Triagem sorológica Anti-HBc IgG (total) Sensibilidade Especificidade

60 Hepatites pós - Transfusionais
HBsAg Exclusão de doadores com fatores de Risco p/ HIV Anti-HIV ALT/Anti-HBc Anti-HCV Testes HCV melhorados Adaptado de HJ Alter and Tobler and Busch, Clin Chem 1997

61 HEPATITES PÓS-TRANSFUSIONAIS
AÇÕES PARA EVITAR AS HEPATITES PÓS-TRANSFUSIONAIS 1965: Descoberto o Antígeno Australia (AgHBs) 1975: Reconhece-se que cerca de 90% de todas as hepatites transmitidas por transfusão eram “não-A, não-B”. (NANB). 1960 1970 1980 Testes AgHBs 3ªgeração aplicados na triagem : Triagem por Anti-HBc e ALT “surrogate tests” para HNANB 1990: Início da Triagem para anti-HCV (1ª G) 1990 2000 AgHBs + Anti-HBc 1991: Triagem por Anti-HBc recomendada pela FDA para reduzir a incidência de hepatite B transmitida por transfusão 1995: NIH/NHLBI Concensus Development Conference recomenda que o teste ALT seja descontinuado; Mantem-se o teste anti-HBc para evitar o risco residual de transmissão do HBV

62 2 e 3: Portadores. (3 = alta infectividade)
Marcadores da Infecção pelo HBV Perfis observados na triagem de doadores 2 e 3: Portadores. (3 = alta infectividade) 4 e 5: Hepatite B oculta. (DNA em baixas concentrações: <103 UI/mL) 6 e 7: Exposto ao HBV? Imune? Anti-HBs? Infectante? 8: Recuperação sorológica

63 Sensibilidade (PEI/mL)
Sensibilidade analítica e Especificidade de alguns kits anti-HBc (total) Testes Anti-HBc Marcas Sensibilidade (PEI/mL) Especificidade (%) bioMérieux 0,7 99,85 Dia Sorin <0,5 99,83 Dade Behring - 99,7 Wiener 99,4 BioKit 1,5 Bio Rad 0,6 99,

64 Ensaio Competitivo H2O2/TMB Anti-HBc Total HRP H2SO4 Fase sólida Soro
AgHBc Soro HRP H2SO4 NEGATIVO

65 Ensaio Indireto: IgG H2O2/TMB Ag HRP Soro Positivo H2SO4 Fase sólida

66 Ensaio Direto “Sandwich”: IgG
Anti-HBs H2O2/TMB HRP Positivo H2SO4 Fase sólida

67 Falhas na detecção do Anti-HBc Avettand-Fenoel V, et al. J. Clin
Falhas na detecção do Anti-HBc Avettand-Fenoel V, et al. J. Clin. Microbiol. 2006 2.169 amostras de soro, AgHBs (+) [hepatite crônica p/ HBV] Apenas 3 mutações HIV (+) = 13 Transplantados = 5 -Pacientes altamente imunocomprometidos -Falta de sensibilidade de alguns kits

68 Tipos de Testes ELISA utilizados para a triagem de doadores de sangue no Brasil

69 RFP e RFN (%) para a triagem por anti-HBc, observados nos PCQES
RFP e RFN (%) para a triagem por anti-HBc, observados nos PCQES* desenvolvidos para Bancos de Sangue no Brasil (2006 – 2007) (*) Programas de Controle de Qualidade Externo em Sorologia

70 Importância do Anti-HBc na triagem sorológica de doadores de sangue
Eliminar o risco residual de transmissão do HBV por transfusão Testes AgHBs com baixa sensibilidade Níveis de AgHBs indetectáveis Mutantes no determinante “a” do HBV Hepatite B oculta

71 AgHBs (neg) Anti-HBc (pos)
Dados da Triagem sorológica para anti-HBc em Regiões de média prevalência para o AgHBs Países AgHBs (neg) Anti-HBc (pos) Paquistão 17,28% Grécia 14,95% Índia 10,82%

72 Triagem sorológica pelo anti-HBc Bhatti FA et al. Transfusion 2007
Paquistão - Transfusão de unidades de sangue: 1,5 milhões de unidades transfundidas anualmente Prevalência de AgHBs (+) em doadores: 2,16% O anti-HBc não é usado na triagem de doadores Estudo do anti-HBc em 966 doadores mostrou: 185 (19%) foram anti-HBc (+) 167 (17,28%) eram AgHBs (-) e anti-HBc (+) Desses 167, 76% eram anti-HBs (+) HBV-DNA foi detectado em 5 doadores que eram AgHBs (-) e anti-HBc (+). Infecção oculta pelo HBV 1 em cada 200 doadores AgHBs negativos ainda poderiam transmitir HBV para os receptores

73 % de Bolsas descartadas na Triagem Sorológica de Doadores de Sangue, por Macroregião – Brasil, Dados HEMOPROD / ANVISA / MS Norte Nordeste Sudeste Centro Oeste Sul Brasil AgHBs 0,6 0,77 0,42 0,43 0,46 0,52 Anti-HBc 8,12 4,29 2,91 4,95 4,92 4,2 Anti-HCV 0,62 0,69 0,47 0,35 0,38 0,51 Anti-HIV 0,9 0,39 0,41 0,27 0,49

74 Importância do Anti-HBc na triagem sorológica de doadores de sangue
Em regiões de baixa prevalência Descarte de 2 a 5% Em regiões de média e alta prevalência para o AgHBs O descarte pode atingir mais de 20% Em regiões com baixa prevalência para o AgHBs, mas onde ocorra intensa transmissão horizontal em crianças, o descarte por anti-HBc em doadores pode chegar aos 10%

75 Alternativas em Regiões com Alta Prevalência de Anti-HBc (+)
Conseguir um pool de doadores negativos para AgHBs e Anti-HBc e motivá-los a doar sangue regularmente Vacinar os doadores com apenas anti-HBc (+) e verificar a soroconversão Importar unidades de sangue de regiões com baixa prevalência de Anti-HBc

76 Alternativas em Regiões com Alta Prevalência de Anti-HBc (+)
Aproveitar doadores anti-HBc (+) Doadores anti-HBc (+) com anti-HBs >100 mUI/mL, Poderiam ser aceitos Doadores anti-HBc (+) com anti-HBs < 100 mUI/mL, só seriam aceitos se fossem HBV-DNA Negativos Controverso, porque a presença de anti-HBs nem sempre é indicativa da ausência de HBV - DNA

77 Alternativas em Regiões com Alta Prevalência de Anti-HBc (+)
Um estudo no Irã com doadores mostrou a presênça de Anti-HBc (+) em 131 (6,55%) sendo que 16 dos 131 (12,2%) eram HBV – DNA (+) Se o anti-HBc é (+) a bolsa de sangue deverá ser Descartada Posteriormente o teste para HBV-DNA pode ser adequado para seguimento da infecção por HBV Behzad-Behbahani A. J. Med. Res. 2006 Arraes LC et al. Rev. Inst. Med. Trop. S.Paulo 2003 Yotsuyanagi H et al. Transfusion, 2001

78 Reatividade de mutantes r-HBsAg, em vários ensaios AgHBs

79 Comportamento dos testes para detecção de AgHBs na presença de mutantes do antígeno de superfície do HBV Coleman PF Emerging Infectious Diseases • • Vol. 12, No. 2, February 2006

80 Desempenho de kits AgHBs para a detecção de mutantes
Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B Virus mutation within “a” determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1): Painel de referência com amostras de doadores de sangue - Tailândia Painel de mutantes AgHBs rec Thr126-Ser Gln129-His Met133-Leu Asp144-Ala Gly145-Arg Thr126-Ser + Gly145-Arg Pro142=Leu + Gly145-Arg Pro142-Ser + Gly145-Arg Asp144-Ala + Gly145=Arg N = 212 amostras 107 AgHBs Negativas 105 AgHBs Positivas

81 Desempenho de diversos kits AgHBs frente a um painel de referência de doadores de sangue na Tailândia Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B Virus mutation within “a” determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1):

82 Kits AgHBs usados no estudo Louisirirotchanakul, S et al
Kits AgHBs usados no estudo Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B Virus mutation within “a” determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1): Ab: Mono/poli Ab: Mono/mono MEIA: microbead enzyme-linked immunoassay; ELFA: enzyme-linked fluorescent assay; EIA: enzyme-linked immunosorbent assay; ECLIA: electrochemiluminescence-linked immunoassay; ECI: enhanced chemiluminescence immunoassay.

83 Desempenho de diversos kits AgHBs frente a um painel de Mutantes AgHBs rec
Louisirirotchanakul, S et al. HBsAg diagnostic kits in the detection of hepatitis B Virus mutation within “a” determinant. Viral. Immunology 2006; 19(1):

84 Desempenho de kits AgHBs para a detecção de mutantes
Roche Mutant Panel (Recombinant) Cut-off of ARCHITECT assay = 0,05 IU/mL Sheiblauer H,Soboll H and Nick S. J. Med. Virol. 78:S66-S70, 2006

85 Desempenho de kits AgHBs para a detecção de mutantes
ABBOTT Coleman Panel Sheiblauer H,Soboll H and Nick S. J. Med. Virol. 78:S66-S70, 2006

86 Desempenho de Kits Ag HBs para a Detecção de Mutantes
Natural Mutant Panel Sheiblauer H,Soboll H and Nick S. J. Med. Virol. 78:S66-S70, 2006

87 Sensitivities of four New commercial hepatitis B surface antigen (HBsAg) assays in detection of HBsAg mutant forms. Thoai Duong Ly et al. J. Clin. Microbiol, july 2006

88 Sensitivities of four New commercial hepatitis B surface antigen (HBsAg) assays in detection of HBsAg mutant forms. Thoai Duong Ly et al. J. Clin. Microbiol, july 2006

89 Desempenho de Kits Ag HBs na Detecção de Mutantes (Ly TD. J. Med. Virol. 2007; 79:S37-S41)
Reactive S/CO: AxSYM = 2; Architect = 0,05 IU/ml; Liaison = 1,1; Vidas ultra = 0,13; los demás = 1

90 Janela Imunológica do HBV
Vírus Testes ELISA NAT HBV 56 dias 31-42 dias 45 (34-66) dias Risco residual de transmissão por transfusão 1: a

91 NAT para HBV na Triagem de doadores de sangue
Doações Doações NAT-HBV (+), AgHBs (-) 10 Rendimento período de janela 1/ Rendimento Infecções HBV ocultas 39 (1/42.100) Sociedade Espanhola de Transfusão Sanguínea, 2007

92 Vírus da Hepatite Delta (HDV)
O HDV precisa da presença do HBV para causar infecção. Distribuição heterogênea ao redor do mundo. Endêmico em algumas regiões da América Latina, Europa e África. Pode estar associado a formas graves de hepatites em algumas regiões do Norte da América do Sul.

93 Vírus da Hepatite Delta (HDV)

94 Marcadores sorológicos da Hepatite por Vírus Delta
Anti-VHD (IgM) Fase aguda Anti-VHD (IgG) Recuperação AgVHD

95

96

97 Diagnóstico da infecção por HDV
AgHBs Anti-HBc IgM Anti-HDV Total Interpretação + Coinfecção Neg Super infecção +/- Infecção passada Ausência de

98 Hepatite por Vírus C (HCV)
A infecção pelo HCV representa um dos mais graves problemas de saúde pública no Brasil e no mundo. 170 milhões de pessoas infectadas pelo HCV, no mundo. Indivíduos infectados pelo HCV Hepatite crônica (80% - 85%) Cirrose hepática (20%) HCC (10% - 20%)

99 História Natural da Hepatite C crônica (50 anos)
Hoofnagle JH, Hepatology 36(5), 2002

100 Prevalência de infecção pelo HCV em doadores de sangue
< 0.1% - Very Low >5% - High 1.1-5% - Intermediate 0.2-1% - Low Unknown Anit-HCV Prevalence * *Anti-HCV defined by EIA and supplemental testing CDC

101 Transmissão do HCV A principal via: parenteral Vertical
Entre usuários de drogas intravenosas Por agulhas e seringas Esterilização inadequada ou reutilização Transfusão Sangüínea Transplante de órgãos Vertical Sexual (ineficiente) Ocupacional

102 Teste para HCV recomendado em:
Usuários de drogas ilícitas injetáveis Quem recebeu fatores de coagulação antes de 1987 Quem recebeu hemocomponentes ou órgãos antes de 1992 Pacientes submetidos a hemodiálise Evidência de doença hepática Profissionais da área da saúde (com suspeita de exposição a sangue contaminado com HCV) Crianças nascidas de mães HCV positivas

103 Recomendações após exposição ao HCV
Seguimento após picadas de agulhas, cortes ou exposição de mucosas a sangue HCV positivo Testar a fonte de contaminação p/ HCV Testar a pessoa exposta, se a fonte for (+) Anti-HCV e ALT, imediato e até 4-6 meses HCV-RNA em 4-6 semanas (+ rápido) Confirmar todos os anti-HCV com IB Encaminhar a pessoa infectada a serviço médico especializado para avaliação e seguimento CDC

104 Risco de infecção após picada com agulha usada em paciente infectado
Vírus Risco HBV 30% HCV 3% HIV 0.3%

105 Padrão Sorológico na Infecção aguda por HCV com Recuperação
Tempo após a Infecção Título anti-HCV 1 2 3 4 5 6 Anos Meses HCV - RNA ALT Normal Mod. CDC, 2002

106 HCV - Evolução para Infecção Crônica
anti-HCV HCV RNA Título ALT Normal 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 Meses Anos Tempo após a infecção

107 Evolução do HCV-RNA, Ag HCV e anti-HCV
Para a cura Evolução Para a cronicidade

108 Detecção da infecção pelo HCV Testes Laboratoriais
Indiretos Pesquisam a presença de anticorpos contra o HCV Diretos Testes de biologia molecular para pesquisa do RNA – HCV Pesquisam a presença do Ag core do HCV Combinação Pesquisam a presença de anticorpos contra o HCV e do Ag core do HCV

109 Estrutura do RNA - HCV ELISA
Estrutural Não-Estrutural -----estrutura processamento replicação ----- C E1 E2 NS2 NS4B NS5A NS5B NS NS4A Fosfoproteína replicação RNA dependente RNA polimerase NS3 cofator Replicação ? Serina protease Helicase Proteínas do envelope Reunião e entrada Nucleocapsídeo C Protease 1ª geração 2ª geração 3ª geração ELISA

110 Testes Laboratoriais – HCV ELISA
1ª Geração – NS4 2ª Geração – Core+NS3+NS4 3ª Geração – Core+NS3+NS4+NS5 Ac IgG + IgM Variantes virais da NS3 4ª Geração – Ag / Ac

111 Testes Laboratoriais - HCV
ELISA MEIA Quimioluminescência (CLIA) Aglutinação de partículas de gelatina Imuno blot Testes rápidos

112 Imunoblot – RIBA HCV 3.0 Positivo Indeterminado Negativo Interpretação
Controle IgG Nível II Nível I c100(p) 5-1-1(p) c33c c22 (p) NS5 hSOD

113 Amostras Repetidamente Reagentes

114 Avaliação de Kits anti-HCV - ELISA
Kit “A” Kit “B” Kit “C” Sensibilidade 100% Especificidade Triagem 99,4% 98,6% 97,9% Triagem + painel de soros (-) e Heterólogos 98,2% Sáez-Alquezar A et al. Laes & Haes 169: 90-94, 2006

115 Ensaios para a detecção do RNA - HCV
Testes qualitativos Limite inferior de detecção: 10 – 50 UI/mL Testes quantitativos* Valor de corte para quantificação do RNA Limite inferior: ~ 600 UI/mL Limite linear superior : – UI/mL (*): Amplificação do alvo (PCR ou TMA ou amplificação do sinal (branched ) A OMS padronizou as unidades de quantificação do RNA-HCV em UI/mL Exemplos de fatores de conversão Cobas Amplicor HCV Monitor. V2,9: 1 UI/mL = 2,7 cópias/ml Versant HCV RNA Quantitative assay: 1 UI/ml = 5,2 cópias/ml

116 Positivo Negativo PCR

117 Nomenclatura dos Diferentes Genótipos do Vírus da Hepatite C
Subtipos 1 1a, 1b, 1c 2 2a, 2b, 2c 3 3a, 3b, 3c 4 4a 5 5a 6 6a Stuyver & Simmonds

118 Genotipagem do HCV INNO - LIPA RFLP
Restriction fragment Lenghtpolymorphism Seqüênciameneto de porções variáveis do genoma

119 Distribuição dos diferentes genótipos do HCV em diferentes regiões
Genótipos 1, 2 e 3. Países Ocidentais , Oriente Próximo Genótipos 5 e 6. África do Sul, Sudeste da Ásia Genótipo 4. Oriente Médio, África Central, Brasil

120 Prevalência dos genótipos do HCV São Paulo – Brasil (N=348)
Doadores de sangue (%) Hemofílicos Transplante renal Hepatite crônica C (%) Total 1 2,9 4,3 75,0 5,2 12,9 1a 17,6 34,8 - 20,3 18,7 1b 38,2 17,4 36,6 31,3 2 5,9 13,0 5,0 3,2 3 32,4 30,4 15,0 33,9 4a 2,5 0,3 Mix 0,8 1,1 Bassit L et al. Rev. Inst. Méd. Trop. São Paulo. v. 41 (3): 183 – 189, May – June, Bassit L et al. Hepatology Vol. 29 (3): 994 – 95,

121 Considerações Sobre o uso de Testes ELISA anti-HCV
Pacientes imunocompetentes Pacientes imunocomprometidos ou em Hemodiálise Pacientes com Hepatite Crônica Populações de alto risco Populações de baixa prevalência Doadores de sangue

122 Hemoterapia Importância da Triagem Sorológica em Doadores de Sangue
Usar testes que diminuam o período da janela imunológica Anti-HCV Combo Ag/Ac Ag NAT (mini pool – amostras individuais)

123 Janela imunológica na infecção pelo HCV com os marcadores utilizados
13 15 70 150 80 Infecção NAT Ag EIA 3ª EIA 2ª EIA 1ª DIAS Ag/Ac

124 Alan Kitchen

125 Example of a representative profile HCV Seroconversion Panel BBI 917 :

126 HCV-Ag/Ac Redução da Janela Imunológica
Ranking on 35 Seroconversion panels, including subtype 1a, 1b, 2b, 3a in average days of delay for detection versus NAT : HCV Ultra detects exposure to HCV with a minimum of 17 days earlier than anti-HCV Ab assays tested : 70 % reduction of the serologic HCV WP

127 Desempenho do HCV-Ag/Ac frente a diferentes Genótipos
A total of 405 genotyped samples were tested : 133 genotypes from various origin 272 genotypes from 2 hospital laboratories All these samples from different genotypes were found positive : 100 % sensitivity (405 / 405) Bio-Rad

128 Janela Imunológica dos vírus HBV, HCV e HIV
Testes ELISA Ag / Ac NAT HBV 56 dias - 31-42 dias HCV 70 dias 25-39 dias ? 23 dias HIV 22 dias 15-16 dias 11 dias

129 Fase inicial da infecção pelo HCV
Eclipse

130 Retrovirus Epidemiology Donor Study [REDS] group
Busch MP. Transfusion 2006; 46:

131 Bianco C.

132 Janela Imunológica com os testes diagnósticos para a infecção por HCV
Anti-HCV 1ª G 150 dias Anti-HCV 2ª G 82 dias Anti-HCV 3ª G 66 dias dias Combo Ag/Ac 12,5 dias* 39,2 dias** 38 dias menos que o anti-HCV NAT 7.4 dias* 31.9 dias** 8 – 9 dias (*)Buch M et al. Transfusion 2005, 45: (**) Laperche S et al. Transfusion :

133 Muito Obrigado