PATOLOGIA O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico

Apresentação em tema: "PATOLOGIA O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico"— Transcrição da apresentação:

1 PATOLOGIA O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico
Vera Luiza Capelozzi Departamento de Patologia Faculdade de Medicina - Universidade de São Paulo – Brazil

2 Imunofluorescência Técnica precursora IHQ: reações antígeno-anticorpo
Tecido fresco congelado, microscópio especial, pobre definição morfológica Anos 80-90: IHQ aplicação ampla na Patologia Cirúrgica Detecção mais sensível: Acs monoclonais altamente específicos, idênticos e em abundância Cortes inicialmente congelados: fixação em formalina e embebição em parafina

3 IHQ: Tipos de Anticorpos
Monoclonais e policlonais monoclonais: mais específicos policlonais: reconhecem diversos epítopos injeção de um antígeno peptídico em animais após a estimulação de resposta imune secundária isolamento dos anticorpos a partir do soro Primários e secundários primários: antígeno de interesse e são não-marcados anticorpos secundários produzidos contra anticorpos primários reconhecem IGs de uma espécie particular e são conjugados : biotina , fosfatase alcalina , peroxidase , Flúor Alexa ou Fluor DyLight

4 IHQ: Preparação das Amostras
Cortes: finos 4μm , micrótomo lâminas Controles padronização processamento e fixação “Controles internos”: tecido (ou células) da mesma secção secção do mesmo espécime da paciente “Controles externos”: tecidos (ou linhas de células) de outras fontes células negativas e outras positivas de expressão do antígeno em questão

5 IHQ: Direta e Indireta Direto (one-step)
anticorpo marcado (e.g. Isotiocianato de Fluoresceína - FITC) conjugado reage diretamente com o antígeno no tecido simples e rápido baixa sensibilidade: pequena amplificação de sinal

6 Ac primário não-marcado (primeira camada)
+ Ag do tecido + Ac secundário marcado (segunda camada) contra IgG da espécie animal na qual Ac primário foi produzido segunda camada Ac marcada com corante fluorescente ou enzima Método mais sensível: amplificação maior: reações Ac secundários com diferentes sítios antigênicos do Ac primário Número pequeno de Ac secundários conjugados (marcados) gerado Ex: Ac secundário marcado produzido contra IgG de coelho (comprado sem encomenda) reage com qualquer Ac primário produzido em coelhos Método direto: produzir Acs marcados customizados contra cada antígeno de interesse

7 HE & IHQ

8 IHQ: Indicações na Patologia Cirúrgica
tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada órgão de origem de uma neoplasia diferenciada subtipagem de neoplasias (linfomas) fatores prognósticos, terapêuticos e índices proliferativos (por exemplo, hormônios) identificação de estruturas, organismos e materiais secretados pelas células detecção de células neoplásicas metastáticas diferenciação proliferação celular maligna e benigna

9 IHQ: Marcadores diagnósticos
técnica excelente de detecção: local exato da proteína no tecido maior desvantagem ao contrário do immunoblotting: coloração checada contra um peso molecular impossível mostrar que a coloração corresponde à proteína de interesse Acs primários devem validados por Western Blot

10 Pan Citoqueratina: celulares epiteliais e todos carcinomas; alguns sarcomas
CD45 (LCA): marcador de leucócitos; HMB45: marcador de melanoma e nevos azul, de Spitz e juncional, angiomiolipoma; S100: células gliais e de Schwann, melanócitos, células de Langerhans e células reticulares interdigitantes Vimentina: marcador de células de origem mesenquimal (sarcomas); Actina: leiomiossarcoma (positivo), câncer papilar de mama (negativo) e outros; Alfafetoproteína (AFP): tumores de células germinativas (seio endodérmico) e carcinoma hepatocelular; BCL-2: linfoma folicular x hiperplasia reacional, subtipos de linfomas, carcinomas e sarcomas; CA 125: ovário, vesícula seminal, colo uterino, endométrio, trato gastrintestinal, tireóide e mama; Antígeno prostático específico (PSA): para câncer de próstata; Receptores de estrogênio e progesterona: marcadores prognósticos em câncer de mama; CD3 (Pan-T): linfomas de células T; CK7: epitélios glandulares e transicional - subtipos de carcinomas, ductos biliares; CD10 : células foliculares e linfoblastos, normais e neoplásicas, estroma endometrial e células renais; CD15: granulócitos maduros, células de Hodgkin e de Reed-Sternberg e diversos adenocarcinomas CD20 (Pan-B): linfomas de células B; CD30 (Ki-1): linfoma de Hodgkin, linfoma de grandes células anaplásico e carcinoma embrionário; CD117 (proto-oncogene c-KIT): estroma gastrointestinal (GIST), carcinomas e leucemias, mastócitos; CK20: tumores gastrointestinais, carcinoma de células transicionais, tumor de células de Merkel; Cromogranina A: diferenciação neuroendócrina; Desmina: células musculares, estriadas ou lisas - tumores musculares lisos e estriados E-caderina: carcinoma ductal x carcinoma lobular de mama Erb-B2/Her-neu: mama, ovário e trato-gastrointestinal. Prognóstico e preditivo em carcinoma de mama; KI-67: marcador de proliferação celular; Proteína P53: produto do gene supressor tumoral marcador prognóstico TTF-1: marcador de carcinomas de pulmão e tireóide e neoplasias neuroendócrinas.

11 CK-7 Caspase-9 TTF1 CD56 Bcl-2 MMP-9 AE1+AE3 CD1a P63 Vimentina IL-4 CD3 CD68

12 Câncer de Pulmão: Tipos Histológicos
Classificação WHO 2004 – Tipos Maiores1 *Inclui CA adenoescamoso, CA sarcomatoides, Carcinoides, CA glândulas salivares, e Carcinomas inclassificáveis Outros* 24.0% Adenocarcinoma 38.3% LCC 5.0% SCLC 13.0% 19.7% SqCC Percentual distribuido entre casos classificaveis, 1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18: SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive),

13 Carcinoma Não-Pequenas Células (NSCLC): Tipos Histológicos
Adenocarcinoma 19% Carc Cels Escamosas Carc Grandes Células 38% Não Especificado (NOS) 14% 29% I would like to come back to this issue about not otherwise specified non-small-cell lung cancer. These are data from the American Cancer Society, and you can see approximately 20% of all non-small-cell lung cancer cases have been classified by pathologists as not otherwise specified. Now, in reality these tumors by and large are of one cell type or the other. A small number of them are actually so poorly differentiated that you would never be able to tell. But in most cases you can tell, if we have adequate tissue. So again, to repeat myself this means we need more and more, if we do a fine needle to do multiple passes, or to obtain a core biopsy at a minimum so that we can both define histology and do molecular analysis. 1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18: SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive),

14 NSLCL: 70% Apresentação como Doença Avançada

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16 Análise molecular de adenocarcinomas
Sem mutação KRAS 22% AKT1 EGFR 17% NRAS MEK1 MET AMP EML4-AKL 7% HER2 Now, this is being done by other groups as well, and this is data that was presented at the World Conference by Bruce Johnson and his colleagues from the Lung Cancer Molecular Consortium. And it shows that in 54% of lung adenocarcinomas that were analyzed, an actionable driver mutation or abnormality was found, so this is the answer to the question I asked you earlier about in what percentage of cases would you find some actionable abnormality? And in this study they referred patients to appropriate biomarker driven clinical trials, based on the specific analysis. PIK3CA 2% BRAF 2% Double Mutants 3% Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado Kris MG, et al. ASCO CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC Abstract O16.01

17 Alvos moleculares potencialmente “tratáveis”
Alvos emergentes “tratáveis” em CA Celulas Escamosas de pulmão Alvos emergentes “tratáveis” em Adenocarcinoma de pulmão K-ras EGFR B-raf HER2 PIK3CA ALK MET Other Gene Evento Frequencia, % FGFR1 Amplificação 20-25 FGFR2 Mutação 5 PIK3CA 9 PTEN Mutação-deleção 18 CCND1 8 CDKN2A Deleção/mutação 45 PDGFRA Amplificacão-mutação EGFR 10 MCL1 BRAF 3 DDR2 Mutacão 4 ERBB2 2 This slide shows some data regarding adenocarcinoma on the left, and then on the right are brand new data that were presented by Hammerman et al at our 2011 World Conference on Lung Cancer. And it displays what we call potential druggable molecular targets. Now, for adenocarcinoma we have already talked about some of these, such as EGFR or ALK. But what I want to draw your attention to is that squamous cell carcinoma, which was a black box, in other words molecularly they looked pretty much the same. We are now realizing that they are also very different from case to case. For example, for genes such as fibroblast growth factor receptor or a number of other abnormalities here, there are mutations or amplifications or deletions which could dictate therapy. There are a number of fibroblast growth factor inhibitors now in development, for example, that we know in animal models are very effective in treating squamous cell carcinomas with amplification of this gene. So we will find out within the next few years the clinical applicability, but the point here is that I think more and more we will be individualizing therapy, even for squamous cell subtypes. Outro (Indeterminado) Bang Y, et al. ASCO Abstract 3. Hammerman P, et al. IASLC WCLC Abstract PRS.1

18 IHQ: Marcadores Diagnósticos
Adenocarcinoma Carc Cels Escamosas TTF1 p63 Travis WD; USCAP 2012

19 IHQ, FISH, PCR: Marcadores Preditivos e Diagnósticos
Gene copy number by FISH for epidermal growth factor receptor Mutation in epidermal growth factor receptor Top=fl uorescent in-situ hybridisation (FISH) EGFR gene amplifi cation (red clusters) and centromere, chromosome 7 (green). Middle=protein expression by immunohistochemistry (Dako, Glostrup, Denmark). Bottom=EGFR mutation in exon 21. Protein expression by immuno-histochemistry for epidermal growth factor receptor Qual Material? Huber Herbst RS, Hirsch FR. Lancet 373 (2009) Amsterdam,

20 Patologia Cirúrgica: Rotina
O que o Tipo de Procedimento na Obtenção da Biópsia pode Oferecer? - biópsia por agulha em múltiplos pontos ou “core” biópsia mínima : como definir histologia e análise molecular? - fatores que influenciam as análises moleculares Como Atender ao que o Patologista pode fazer? Como Facilitar o que quer saber o Oncologista?

21 Kevin L, USCAP 2012

22 Kevin L, USCAP 2012

23 Optimizando o Diagnóstico em Biópsias Pequenas

24 Histologia: grupo de células incluso maligno “não pequenas” células não favorece adenocarcinoma pela morfologia Recomendável IHC para confirmar origem pulmonar Resultados: TTF1 neg, CK7 pos Tumor insuficiente recortes: Napsin A, CK20, sinaptofisina, cromogranina, e P40... Laudo: “carcinoma não pequenas células, NOS”, clínico pergunta: tumor de uma paciente com antecedentes de câncer de mama... ... se for, recomendável pesquisa de Her2neu

25 Se pensarmos: mais a favor de adenocarcinoma precisamos saber se trata de AIS Se não: como temos certeza da ausência de diferenciação escamosa recomendamos pesquisa de EGFR e ALK

26 Mudanças na Histologia do Câncer de Pulmão
Pequenas Células (SCLC) 15% de todo câncer de pulmão incidência em declínio Não-Pequenas Células (NSCLC) 80% de todo câncer de pulmão tipos de NSCLC : células escamosas adenocarcinoma grandes células

27 Carcinoma não-pequenas células
Adenocarcinoma - padrão glandular mucina positiva (50%) CK7+/CK20- TTF1+ Napsin A Carcinoma células escamosas queratinização celular pontes intercelulares escamas córneas CK7-/CK20- P63+ CK5/6+ WHO Comum, mas não 100% WHO Comum, mas não 100%

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29 NSCLC – NOS – MICROSCOPIA ÓPTICA

30 NSCLC – FAVORECE ADENOCARCINOMA
TTF1 TTF1

31 NSCLC- FAVORECE ADENOCARCINOMA CONFIRMADO PELA MOLECULAR
Travis W, USCAP 2012

32 NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA
Travis W, USCAP 2012

33 NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA
BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA

34 NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA- BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA
Travis W, USCAP 2012

35 MUTAÇÃO EGFR – ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE SINALIZAÇÃO
Travis W, USCAP 2012

36 EGFR – EXON 21 – L858R- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA
Brevet M et al. J Mol Diagn 12: , 2010

37 EGFR – EXON 19 – DELEÇÃO- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA
Brevet M et al. J Mol Diagn 12: , 2010

38 Análise molecular de adenocarcinomas
Sem mutação KRAS 22% AKT1 EGFR 17% NRAS MEK1 MET AMP EML4-AKL 7% HER2 Now, this is being done by other groups as well, and this is data that was presented at the World Conference by Bruce Johnson and his colleagues from the Lung Cancer Molecular Consortium. And it shows that in 54% of lung adenocarcinomas that were analyzed, an actionable driver mutation or abnormality was found, so this is the answer to the question I asked you earlier about in what percentage of cases would you find some actionable abnormality? And in this study they referred patients to appropriate biomarker driven clinical trials, based on the specific analysis. PIK3CA 2% BRAF 2% Double Mutants 3% Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado Kris MG, et al. ASCO CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC Abstract O16.01

39 Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão
Quantificação da Expressão do EGFR FLEX Baixa EGFR IHC score <200 N=776; 69% Alta EGFR IHC score ≥200 N=345; 31% IHC score=0* IHC score=112 IHC score=270 Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão Huber Amsterdam, Pirker, WCLC 2011, Abst O01.06 *This field 39

40 EGFR-Anticorpo – FLEX Chemotherapy + Cetuximab Chemotherapy
Maintenance NSCLC wet IIIB/IV EGFR- expressing Chemotherapy + Cetuximab Cetuximab until PD or intolerable toxicity Chemotherapy Chemotherapy (CT) Cetuximab Cisplatin 80 mg/m2 day 1 Vinorelbine 25 (30) mg/m2 days 1, 8 Every 3 weeks, up to 6 cycles initial dose 400 mg/m2 then 250 mg/m2 weekly Pirker R et al. J Clin Oncol 2008, 18S (abstract 3), Lancet 2009;373: 1525–31 Huber Amsterdam, Huber

41 FLEX: sobrevida Pirker R ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373: 1525–31
Median OS 1-year survival CT + cetuximab (n=557) 11.3 mo 47% CT (n=568) 10.1 mo 42% No effect of kRAS-Mutation and EGFR-FISH O'Byrne P ea. ASCO 2009 CT, chemotherapy; HR, hazard ratio; OS, overall survival Pirker R ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373: 1525–31 Huber Amsterdam, Huber

42 Sobrevida com Alta Expressão EGFR (N=345)
Survival Median 1-year 2-year CT + cetuximab 12.0 mo 50% 24% CT 9.6 mo 37% 15% HR*=0.73 [95% CI 0.58–0.93], p=0.011† 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Overall survival (%) 18 6 12 24 30 Months Number of patients at risk Number of patients at risk Number of patients at risk CT + cetuximab 178 128 24 86 61 CT + cetuximab 178 128 24 86 61 CT + cetuximab 178 128 24 86 61 CT 167 108 11 58 36 CT 167 108 11 58 36 Huber Amsterdam, *When adjusted for prognostic factors: HR 0.67 [95% CI 0.52–0.87], p=0.002; †Logrank

43 CONCLUSÃO OBRIGADA!! Medicina Personalizada do Paciente
Câncer de Pulmão Avançado deve ser Direcionada para Histologia e Genética (IHQ, ISH, PCR) OBRIGADA!!