A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Influência da espécie de triatomíneo na seleção de subpopulações em infecções mistas de Trypanosoma cruzi Renato Santana de Aguiar Orientadora: Profa.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Influência da espécie de triatomíneo na seleção de subpopulações em infecções mistas de Trypanosoma cruzi Renato Santana de Aguiar Orientadora: Profa."— Transcrição da apresentação:

1 Influência da espécie de triatomíneo na seleção de subpopulações em infecções mistas de Trypanosoma cruzi Renato Santana de Aguiar Orientadora: Profa. Andréa Mara Macedo Co-orientador: Prof. Sérgio Danilo Pena Colaboração: Prof. Egler Chiari Laboratório de Genética Bioquímica Laboratório de Biologia do Trypanosoma cruzi

2 A DESCOBERTA 1909 Flagelados sangüíneos P. megistus

3 PREVALÊNCIA E TRANSMISSÃO Vetorial: 80% Transfusional: 17% Modos de Transmissão Congênita: 2% Outros: 1%

4 ? Cardíaca Digestiva Indeterminada Sinal de Romanã FASE AGUDA FASE CRÔNICA INFECÇÃO HUMANA

5 A doença de Chagas indeterminada cardíaca digestiva cardio-digestiva Fase crônica: indeterminada cardíaca digestiva cardio-digestiva Dias, 1985

6 Ciclos de transmissão Ciclo silvestre Ciclo doméstico

7 Vetores e reservatórios Triatoma infestans Triatoma brasiliensis Panstrongylus megistus Triatoma pseudomaculata Triatoma sordida Principais vetores Principais reservatórios marsupiais desdentados roedores carnívoros lagomorfos primatas

8 Variedade Populacional de T. cruzi 1909 Morfologia Virulência/patogenicidade Cinética de crescimento Susceptibilidade à drogas Constituição antigênica Propriedades imunológicas Infectividade em céls. hospd. Biológica

9 Isoenzimas Z1 Z2 Z3 Gambás e triatomíneos silvestres Humanos Amazônia Esquizodema rRNA Mini-exon Grupo 1 - ciclo doméstico Grupo 2 - ciclo silvestre Protéico kDNA DNA nuclear

10 Simpósio Internacional Comemorativo dos 90 anos da Descoberta da Doença de Chagas Rio de Janeiro, 1999 T. cruzi I T. cruzi II T. cruzi Zimodema 1 (Miles e cols., 1977) Ribodemas II/III (Clark & Pung, 1994) Grupo 2 do rRNA (Souto e cols., 1996) Zimodema 2 (Miles e cols., 1977) Ribodemas I (Clark & Pung, 1994) Grupo 1 do rRNA (Souto e cols., 1996) Cepas sem caracterização ou inconclusivas

11 A doença de Chagas

12 INFECÇÃO POLICLONAL PARASITAS PARA ANÁLISE MOLECULAR ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DE PARASITAS in vitro REDUÇÃO POPULACIONAL ?

13 AT CCG CA Microssatélites de DNA Taxa de mutação: a Dispersos em todo o genoma Altamente polimórficos

14 CA GT CA GT CA GT CA GT CA GT CA GT CA GT Replicação do DNA Alça na fita moldeAlça na fita nascente Inserção Deleção

15 Microssatélites de repetição (CA) n no genoma de T. cruzi

16 alelo A alelo B alelo C AA ABACBBBCCC Amplificação de microssatélites (PCR)

17 Avaliar a influência de espécies de triatomíneos provenientes de diferentes ecótopos na seleção de sub- populações em infecções mistas de T. cruzi, através da amplificação de microssatélites de DNA diretamente das fezes de triatomíneos infectados.

18 ESTABILIDADE DOS MICROSSATÉLITES

19 Cultivo de 70 gerações do clone CL Brener Parental 10 a geração 20 a geração 30 a geração 40 a geração 50 a geração 60 a geração 70 a geração Amplificação por PCR Locos: SCLE10, SCLE11, MCLE01, MCL03, MCL05, MCLE08, MCLG10 e MCLF10

20 ALF Detecção de polimorfismos de microssatélites LASER PCR

21 Eletrofluorograma das 70 gerações do clone CL Brener 10 a 20 a 40 a 50 a 60 a 70 a parental 30 a MCLG10 parental 10 a MCL05 40 a 30 a 20 a 70 a 60 a 50 a

22 Estabilidade dos microssatélites de T. cruzi

23 Conclusões Os microssatélites de repetição (CA) n dos locos: SCLE10, SCLE11, MCLE01, MCL03, MCL05, MCLE08, MCLF10 e MCLG10 do clone CL Brener de T. cruzi não se alteraram nas 70 gerações avaliadas. Os microssatélites de repetição (CA) n do genoma de T. cruzi são altamente estáveis em condições laboratoriais, sendo portanto, bons marcadores genéticos a serem utilizados nas infecções experimentais em triatomíneos.

24 ESTUDOS POPULACIONAIS DE ISOLADOS NATURAIS DE T. cruzi

25 Isolados naturais de T. cruzi Mico leão dourado (3) Gambá (1) Humanos (6) Humanos (3) Triatomíneos (8) Gambá (2) Silvestres:14 Domésticos:14 Humanos (5)

26 Metodologia Locos de microssatélites amplificados SCLE10 SCLE11 MCLE01 MCLF10 MCLG10 Eletroforese em seqüenciador automático de DNA ALF

27 A B C D Perfis de amplificações A e B (200 pm e Ig 62 / humano) monoclonais C e D ( RB VII, RB III / Rhodnius brethesi) multiclonais MCLE01

28 Infecções mistas em triatomímeos Reservatórios Número de cepas MonoclonalMulticlonalTotal triatomíneos silvestres 3 (37,5%)5 (62,5%)8 mamíferos silvestres 6 (100 %)-6 humanos12 (85,7%)2 (14,3%)14 total21 (75%)7 (25%)28

29 Cepas multiclonais RBII, RBIII, RBVII, RB VIII, RB X, JJ/AM e AM16 Coura e cols., 1994

30 LOCOS DE MICROSSATÉLITES SCLE10SCLE11MCLE01MCLF10MCLG10CEPAS pb

31 Caracterização da região 3 do gene 24S rRNA Gene rRNA 24S ABC 125 bp bp - Grupo 1Grupo 1/2Grupo 2 53

32 11 1 Grupo 2 rRNA 24S Grupo 1 rRNA 24S LEGENDA Rede de Wagner Método da Máxima Parcimônia 20 cepas de T. cruzi

33 Evidências da clonalidade de T. cruzi Loco n o de alelos Variação dos alelos (pb) Heterozigosidade esperada Heterozigosidade observada MCLE MCLF MCLG SCLE SCLE Cálculo da heterozigosidade (GENETIX, H = 1 - X i 2 ) Desvio de equilíbrio de Hardy-Weinberg

34 Conclusões Os microsstélites de repetição (CA) n são ferramentas poderosas na avaliação da clonalidade de uma cepa de T. cruzi. Os maiores índices de infecções mistas foram encontrados em isolados naturais de triatomíneos silvestres. A maioria dos isolados naturais de pacientes chagásicos são constituídos de apenas uma população de T. cruzi.

35 Conclusões Os microssatélites foram capazes de separar os isolados naturais de T. cruzi em dois grupos, fortemente correlacionados com as tipagens realizadas pelo gene do rRNA. A separação entre os grupos de T. cruzi proposta pelos microssatélites pode ser também correlacionada com os ciclos silvestre e doméstico dos parasitas, exceções feitas às amostras isoladas de primatas.

36 DESENVOLVIMENTO DE INFECÇÕES MISTAS DE T. cruzi EM TRIATOMÍNEOS

37 CL Brener Col1.7G2 JG PNM Mistura SCLE

38 Infecções experimentais em triatomíneos Dipetalogaster maximus Ninfas de 3° estágio

39 CLJGPNM Obtenção de tripomastigotas sangüíneas Alimentação de triatomíneos CL + JG + PNM JGPNM CL JGPNM CL JGPNM CL 200 parasitas/ml 67parasitas/ml de cada

40 Alimentação artificial dos triatomíneos A parafilme B recipiente para o sangue C sangue D câmara aquecida (37°C) E conector do banho maria circulante

41 Coleta do contéudo intestinal dos triatomíneos Tempo de infecção 30 e 60 dias Extração de DNA total Proteinase K Guanidina 6M Lise Alcalina Fervura

42 Padronização da metodologia SCLE10 D. maximus infectados com CL Brener (60 dias de infecção)

43 Infecções mistas de T. cruzi em triatomíneos de diferentes ecótopos X Triatoma infestans (doméstico) Rhodnius neglectus (silvestre)

44 Infecções em T. infestans Infecções isoladas 200 parasitas/ml CL Brener Col1.7G2 JG PNM Infecções mistas CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por pop. 30 dias CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por pop. 60 dias CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 200 parasitas/ml por pop. 60 dias

45 CL BrenerCol1.7G2PNMJG PNM CL BrenerCol1.7G2PNMJG PNM Infecções isoladas em T. infestans - SCLE10 Col1.7G2JG

46 CL BrenerCol1.7G2PNMJGCLPNM CL BrenerCol1.7G2PNMJG PNM Infecções isoladas em T. infestans - SCLE10 CL BrenerPNM

47 Infecções isoladas em T. infestans CLBrener Infecções realizadas % de fezes positivas Col1.7G2PNM JG Infecções isoladas emT.infestans 200 parasitas/ml 60 dias SCLE10

48 Infecções mistas em T. infestans CL Brener Col1.7G2PNMJGCLPNM CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml 60 dias T. Infestans infectados SCLE10 C - C +

49 Infecções mistas em T. infestans 50 parasitas/ml por pop. 30 dias 50 parasitas/ml por pop. 60 dias 200 parasitas/ml por pop. 60 dias Protocolos de infecção SCLE10

50 Ausência do clone CL Brener na infecção mista Protocolos de infecções CLBrener+Col1.7G2+PNM+JG Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por população 60 dias Populações de T.cruzi detectadas % de fezes positivas Infecções mistas emT.infestansInfecções mistas emT.infestans CLBrener Col1.7G2 PNMJG Populações de T.cruzi detectadas % de fezes positivas

51 Infecções isoladas em R. neglectus R.Infecções isoladas em neglectus Infecções realizadas % de fezes positivas CLBrenerCol1.7G2PNMJG 200 parasitas/ml 60 dias SCLE10

52 Infecções mistas em R. neglectus CL Brener PNM JG Col1.7G2 JGPNM C + R. neglectus Infecção mista 60 dias SCLE10 CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG (50 parasitas/ml por população)

53 Infecções mistas em R. neglectus CL Brener Col1.7G2PNM JG Populações de T. cruzi detectadas % de insetos infectados CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG (50 parasitas/ml por população) Tempo de infecção 30 dias 60 dias SCLE10

54 Reduções populacionais em T. infestans e em R. neglectus CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG (50 parasitas/ml por população) infecções T. infestans 30 dias T. infestans 60 dias R. neglectus 30 dias R. neglectus 60 dias número de populações deT.cruzi detectadas % de fezes infectadas número de populações deT.cruzi detectadas % de fezes infectadas

55 Conclusões Padronizamos uma metodologia capaz de identificar e caracterizar populações de T. cruzi presentes em infecções mistas diretamente nas fezes de triatomíneos infectados, utilizando microssatélites de DNA. As populações de T. cruzi: CL Brener, Col1.7G2, PNM e JG são capazes de estabelecerem consideráveis níveis de infecções quando infectadas isoladamente em ambas espécies de triatomíneos: T. infestans e R. neglectus. Detectamos uma seleção positiva para o clone CL Brener, em detrimento do desaparecimento gradativo das demais populações de T. cruzi em T. infestans submetidos às infecções mistas.

56 Não encontramos seleção para nenhuma das populações de T. cruzi presentes nas infecções mistas em R. neglectus, visto que todas as populações do parasita foram encontradas em proporções semelhantes nas fezes dos triatomíneos infectados. O nível de redução populacional das infecções mistas em T. infestans foi maior do que o encontrado nos R. neglectus. Todos estes resultados indicam um comportamento diferencial de infecções mistas de T. cruzi em diferentes espécies de triatomíneos. Conclusões

57 Agradecimentos À profa. Andréa Mara Macedo Ao prof. Sérgio Pena Aos professores Egler Chiari e Lúcia Galvão À profa. Mirian Martins Aos professores: Octávio Fernandes, Liléia Diotaiuti e Bianca Zingales A todos os amigos do Laboratório de Genética Bioquímica À Neuzinha, Katita, Miroca e Afonso. Aos meus pais.


Carregar ppt "Influência da espécie de triatomíneo na seleção de subpopulações em infecções mistas de Trypanosoma cruzi Renato Santana de Aguiar Orientadora: Profa."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google