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Dalila Zanette Alterações no perfil de expressão gênica e do imunofenótipo de CPHs CD34+ expandidas ex vivo Panepucci RA, Molfeta GA, Araujo AG, Silva-Jr.

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1 Dalila Zanette Alterações no perfil de expressão gênica e do imunofenótipo de CPHs CD34+ expandidas ex vivo Panepucci RA, Molfeta GA, Araujo AG, Silva-Jr WA, Palma PBV, Menezes CCBO, Delgado MO, Covas DT Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Zago

2 Transplante de células progenitoras hematopoéticas de SCU Menos utilizadas do que medula óssea ou sangue periférico mobilizado Baixo numero de células Afeta diretamente o sucesso do transplante

3 Expansão in vitro: várias tentativas Células expandidas apresentam menor enxertia Perda da capacidade de repopulação in vivo ?????

4 Maior obstáculo da expansão A PRÓPRIA PROLIFERAÇÃO ESTIMULA A DIFERENCIAÇÃO E A PERDA GRADUAL DA CAPACIDADE DE REPOVOAR TER PROLIFERAÇÃO Preservar auto-renovação Evitar a diferenciação

5 Na ausencia total de estroma: perda gradual da capacidade de repovoar Quais os genes envolvidos nesta perda ? Quais os genes afetados pela ausência do estroma ? Melhores resultados até hoje: CPHs co-cultivadas com estroma humano Maior obstáculo da expansão

6 Objetivos

7 Avaliar os efeitos da expansão sobre a expressão gênica de células CD34+ Avaliar os mecanismos genéticos envolvidos na adaptação ao meio ex vivo na ausência de estroma Objetivos Como estas mudanças alteram a capacidade de repovoar e a capacidade de diferenciação das células expandidas

8 Células recém-isoladas T0 - CD 34 pureza - Imunofenótipo - Viabilidade - CFC ensaios clonogênicos - RNA : microarrays e qPCR CD dias de cultivo MNC Células expandidas por 3 dias T3 - Imunofenótipo - Viabilidade - CFC ensaios clonogênicos - RNA : microarrays e qPCR

9 Protocolo de expansão utilizado Free Style Medium (Invitrogen) 1% de human albumin TPO FLT3 lig SCF IL-6 3 dias Sem estroma e sem soro bovino fetal

10 Microarrays de oligonucleotídeos: plataforma Codelink Cerca de genes/transcritos

11 13 amostras T0T3 In vitro Expanded for 3 days 2 pools Freshly isolated Reguladas POSITIVAMENTE pela expansão Reguladas NEGATIVAMENTE pela expansão Microarrays de oligonucleotídeos: plataforma Codelink

12 Resultados e Discussão

13 Viabilidade celular Mais de 75% de viabilidade No dia 3 t0 : média 63% viáveis t3 : média 75% viáveis t7 : média 54% viáveis

14 Expressão gênica In vitro: Quais as diferenças na expressão gênica de células CD34+ recém-isoladas e expandidas ex vivo ?

15 Microarrays : 40 genes mais expressos em T3 GeneRazãoGeneRazãoGeneRazãoGeneRazão UBTD1126,3TAS2R121,9PACSIN315,8AMBP12,0 GSS110,2STAT221,7PCK215,2PLK111,8 ANGPTL366,6PIH1D119,8P2RX714,4USP211,2 BBC360,2AFG3L219,7XPO714,2IL9R10,9 ADAM1852,1ITIH117,9MRC113,9CYLC110,8 CAMK448,7WNT5B17,9PHLDA213,4RBP410,5 PHLDA142,1ADAMTS 10 17,3TDRD613,1BUB110,4 TOM1L133,1KIF1B16,6GAL12,1HSD3B710,1 KIF2C25,2GMIP16,3SMAD612,1PGF10,0 INMT24,2INMT24,2AMBP12,0FBLN110,0 DDX2523,9DDX2523,9PLK111,8CD269,9

16 Genes validados e classes funcionais (Real Time qPCR) Proliferation IL9R SMAD6 Apoptosis BIRC5 or survivin Cell cycle CDC25C CCND1 WNT pathway WNT5B WIF1 GSK3B Self-renewal HOXB4 Bmi-1 Polarity, cell division AKT1 PTEN Processos associados à expansão ex vivo e à auto-renovação

17 Via de sinalização WNT Katoh M and Katoh M, 2007 Beta-catenin dependentBeta-catenin independent CANONICAL NONCANONICAL

18 Canônica Regula a escolha do destino das células progenitoras durante o desenvolvimento embrionário e também na homeostase dos tecidos adultos Não-Canônica - Regula indiretamente a escolha do destino das células progenitoras durante o desenvolvimento embrionário e também na homeostase dos tecidos adultos através da inibição da via canônica - Polaridade celular e migração celular Via de sinalização WNT

19 Via não-canônica Não sinaliza através da beta-catenin; Em alguns casos inibe a via canônica; Também necessita de Fzd como receptor, mas não precisa de LRP5/6; A via NC, divide-se em 3 outras sub-vias: duas delas liberam íons Cálcio no citoplasma, que são a via da adesão e da morfologia celular. A terceira é a via da polaridade celular;

20 Via de sinalização WNT WNT1 (1,5) WNT2 (1,8) WNT2B (1,3) WNT3A (NA) WNT4 (-1,2) WNT5A (NA) WNT5B (10) WNT7A (-1,2) WNT10B (-1,2) WISP2 (1,2) WISP3 (1,0) FZD9 (7,5) GSK3B (-1,1) CTNNB1 (-1,5) AXIN 2 (1) WIF-1 (-5) DKK1 (4,8) WNT5B Inibe a via canônica Ativa a via não-canônica ~WNT5A FZD9 Receptor WIF1 Inibidor das duas vias, canônica e não-canônica DKK1 Inibidor específico da via canônica

21 Polarização de CPHs cultivadas in vitro: evento comum na ausência de estroma e na presença e citocinas Divisões assimétricas Perda da capacidade de repopulação Giebel et al, 2004 Giebel B and Bruns I, 2008 Via de sinalização WNT e polarização

22 Via não-canônica WNT Divisões assimétricas Polaridade Auto-renovação Outras vias regulam a polarização: PI3K-AKT Sinalização do Cálcio EGF Via de sinalização WNT e polarização das CPH

23 Não-canônica e PI3K-AKT Kawasaki et al, 2007 Wnt and PI3K-AKT estão relacionadas em gliomas Pu et al, 2008 Via de sinalização WNT e outras vias

24 Dados divergentes sobre a via WNT e CPH Wnt5a (não-canonica) : aumenta a atividade de repopulação das CPH Wnt3a (canônica) : não aumenta a enxertia Nemeth et al, 2007 Reya et al, 2003 A beta-catenina aumenta a auto-renovação in vitro Jeannet et al, 2007 A hematopoese a longo-prazo independe de cateninas

25 A via não-canônica está mais ativa nas células cultivadas ? Isso interfere na capacidade de repovoar destas células ? Hipótese Via de sinalização WNT e CPH

26 Silenciamento do Wnt5b - siRNAs para o silenciamento do gene WNT5b - faremos a cultura exatamente como antes, incluindo controles e também amostras nas quais o WNT5B será silenciado - Avaliaremos se houve transfecção através de um controle fluorescente - avaliaremos se houve silenciamento do gene por real-time PCR para o WNT5B - Avaliaremos se a proteína WNT5B é alterada, com Ac anti-WNT5b

27 Consequências Na morfologia: verificar polarização Na expressão de marcadores de superfície Na expressão gênica de alvos abaixo de WNT e outros membros da via WNT (WNT5A, WNT8A, DKK1, GSK3B, beta-catenin, OCT3/4, NANOG, SOX2 e Axin 2) Na capacidade de formar colônias eritróides e mielóides Na proliferação das células Silenciamento do Wnt5b

28 Genes mais expressos em CPHs cultivadas Divisão celular Mitose Fuso Mitótico Organização do citoesqueleto Polaridade Assimetria Marcadores de superfície

29 Quiescence abrogation Genes mais expressos em CPHs cultivadas : mitose

30 KIF2C KIF1B AURKB CPC complex (+BIRC5, borealin, Incenp) (p+) centrômeros KIF20A PLK1 Fuso mitótico e centrossomos : interligam os eventos de : Divisões assimétricas, polaridade e auto-renovação Razões maiores do que 10 Genes mais expressos em CPHs cultivadas : fuso mitótico

31 Validação dos genes mais expressos: qPCR

32 Validação dos genes da via WNT: qPCR

33 Validação de genes de auto-renovação : qPCR

34 Via não-canônica do WNT e expansão ex vivo Silencing WNT5B (siRNA) Expressão de marcadores ee superfície Ensaios clonogênicos Proliferação Ciclo celular Polaridade Expressão dos alvos e outros membros da via não-canônica To confirm:

35 Microarrays : 10 genes menos expressos em T3 AREG-431ARHGAP20-16 IFI44L-62ELAVL4-15 TPPP3-57VPREB3-15 CRTAC1-53CLEC4E-14 RGS1-49S100A12-14 CXCL10-38KLF2-13 SNF1LK-37CD69-13 SERPINA1-25RAG2-12 CD20-20HIST2H2BE-12 PDE4B-16SKT17B-12 GENE t0 / t3

36 Amphiregulin ou AREG: 431 vezes menos expresso Não há redundância funcional com outros ligantes de EGFR1 Autócrina ou parácrina Fator auto-renovação células neurais adultas Diferenças in vivo e in vitro ??? Epiregulin, Neuregulin, TGF- AREG é expressa na placenta (gestação) Membrana celular Citoplasma

37 Células CD34 + /CXCR4 + > homing CXCR4 e homing CXCR4+ SDF-1 + NICHOCPH migram SDF-1 + As CPHs de SCU < homing do que CPHs de MO

38 CXCR4 e homing p<0,0001 t0t3 Razão= – 9 (microarray) Razão = -24 (qPCR) Ausência de estroma (SDF-1) HIF-1 – 4 vezes menos expresso em t3 CD26 – 10 vezes menos expresso em t3 Via CXCR4/SDF-1

39 Células CD34 + /CXCR4 + t0t3 p = 0,8 t0t3 p = 0,05 % Expressão dinâmica do receptor CXCR4 na membrana – demora na enxertia Maior capacidade de homing

40 Genes reguladores de CPHs Auto-renovação Retenção na medula Mobilização Diferenciação Proliferação Funções críticas de CPHs Fatores de transcrição Reguladores extrínsecos e Reguladores intrínsecos

41 Genes reguladores de CPHs Reguladores intrínsecos Fatores de transcrição nível de expressão Símbolo do GeneRazão microarray Razão qPCR HOXB41,3- 1,9 SLAMF11,5NA BMI-11,5-3,3 FLT3- 4,3NA SCL2,8 RUNX11,1NA BMP4-1,1 ZFX-1,2NA TEK ou Tie21,2NA MLL41,8NA ABCB1-3.7NA Não houve grande alteração

42 HOXB4 : homeobox B4 Super-expressão aumenta a expansão ex vivo e in vivo Aumenta a capacidade de reconstituição Alvos não alteraram : FOXO3A, TNFRSF1B, BAMBI, SOCS2 e outros Diferenciação expressão de HOXB4 t0t3 p=0,0002 Células cultivadas : razão = -2

43 Notch FGF Sinalização de citocinas Hedgehog Proteínas G TNF- TGF- Apoptose/ stress Ciclo celular Wnt HOXB4 : homeobox B4

44 Bmi-1 (polycomb group family member 4) t0t3 p= 0,0005 Razão microarray = 1,5 Razão qPCR = -3,3

45 Bmi-1 Divisões simétricas – auto-renovação intacta Mantém células quiescentes, sem exaustão Perda da expressão de Bmi-1 correlaciona-se com a perda da capacidade de reconstituição e com apoptose

46 Bmi-1 Bmi-1 ocasiona descontrole da proliferação e apoptose Repressão da transcrição de alvos p16 INK4a e p19 ARF Proliferação

47 Conclusões Aumento do número total de células e do número de células CD34 + Aumento médio do número de células CD34 + /CD38 neg e CD34 + /CD90 + Não houve indução da apoptose Conservação da capacidade de diferenciação (ensaios clonogênicos) Validação da expressão dos genes analisados no microarranjo por qPCR A menor expressão de HOXB4 e Bmi-1, relacionados à perda gradativa da capacidade de auto-renovação e também associada à diferenciação

48 Conclusões Menor expressão de CXCR4 indica menor capacidade de homing e enxertia A maior expressão de genes relacionados ao ciclo celular e mitose reflete a grande atividade proliferativa das células cultivadas in vitro A maior expressão de genes relacionados à organização do fuso mitótico parece estar vinculada à alterações na polaridade celular que interferem na ocorrência de divisoes assimétricas in vitro Melhor compreensão da perda gradativa da capacidade de auto-renovação e reconstituição associada à expansão in vitro


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