PCR PCR – polymerase chain reaction Reação em cadeia da polimerase PCR- consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA A partir de uma molécula de DNA, pode-se obter 1 bilhão de cópias!!!!!!

PCR A PCR é um método de amplificação rápida de segmentos alvos da molécula de DNA e cDNA. Os produtos da PCR são também chamados de amplicons.

Como surgiu a técnica da PCR??? – Kary Mullis – desenvolvimento da técnica que tinha muitas aplicações no diagnóstico de doenças genéticas Cetus Corporation of Emeryville California 1993 – Prêmio Nobel em química

Fases da PCR Desnaturação inicial (95oC – 5 minutos) Desnaturação (95oC – 15 s a 1 min) Anelamento (50 a 65oC – 1min) Extensão (72oC – 1min) Extensão final (72oC – 10 min) Resfriamento (4-10oC - ∞) ciclos

Alternância de temperatura a cada ciclo Desnaturação: Separação da dupla fita Separação da dupla fita Anelamento: Os primers ligam-se a regiões específicas na fita simples de DNA Extensão: Temperatura ótima da enzima Taq DNA polimerase

1989-Taq DNA polimerase termoestável Evolução da PCR 1989-Taq DNA polimerase termoestável Automação da PCR Lago do Yellowstone National Park

Evolução da PCR

Síntese da nova fita

POLIMERIZAÇÃO NO SENTIDO 5’  3’ Todas as DNA polimerases requerem para o seu funcionamento: Molécula de DNA (molde) “Primers” de oligonucleotídeo Magnésio dNTPs

Mg2+ primers dCTP dTTP dATP dGTP DNA polimerase

Síntese da nova fita Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos “primers” serve como template para síntese de uma nova fita. Isso garante o aumento exponencial do número de novas fitas. Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm a sequência dos primers na extremidade 5’ e a seqüência complementar aos primers na posição 3’.

Aumento exponencial da fita de DNA 1º ciclo - 2 moléculas DNA 2º ciclo – 4 moléculas DNA 3º ciclo – 8 moléculas DNA

Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR A localização da seqüência alvo é feita pelos “primers” que são oligonucleotídeos com 20-24 bases. Os primers são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal como o genoma humano. O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, segundo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick: A=T C=G

Cinética da PCR Fase de “screening” - ciclos iniciais Os “primers” procuram o “template” de DNA com as seqüências que lhes são complementares (agem como as sondas nos experimentos de hibridação). Encontrar a seqüência complementar não é tão difícil, pois os primers estão em considerável excesso em relação ao template. Fase intermediária O processo de amplificação está ocorrendo, levando ao acúmulo exponencial do fragmento de DNA. O pareamento do primer com a seqüência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das seqüências alvo. Fase tardia ou fase de platô A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes e à competição dos produtos gerados com os primers disponíveis.

O aumento exponencial do número de cópias ocorre até um determinado número de ciclos, que será variável de reação para reação. As causas do platô são várias: -Perda da atividade da enzima Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA. -Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre sí, em detrimento do pareamento com os “primers”. Aumenta possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos. -Gasto dos reagentes, especialmente de primers, mas também de deoxinucleotídeos. -Acúmulo de pirofosfato, resultante das ligações fosfodiésteres. -Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor mas também foram se acumulando, etc…

1 µg de DNA genômico tem 3x105 cópias do genoma de mamíferos. No - número inicial de cópias do DNA dupla fita Nf - número final de cópias da sequência alvo (dupla fita) Y – eficiência da extensão do “primer” por ciclo n = número de ciclos

Análise do produto de PCR

Brometo de etídio Composto fluorescente que se intercala entre as bases do ácido nucléico permitindo a sua visualização em um gel de agarose.

Análise do produto de PCR

Padronização da técnica de PCR Por que realizar a etapa de padronização? Aumentar a eficiência da reação; Aumentar a especificidade; Proporcionar reprodutibilidade.

Parâmetros a serem considerados Desenho do primer Condições de ciclagem Concentrações do reagente Componentes do tampão

Desenho do primer 15 a 30 nucleotídeos na região complementar Distribuição com uma quantidade média do conteúdo de G+C O pareamento da base na porção final 3’ é crítica Evitar regiões muito longas contendo as ligações A-T e G-C se possível Checar por estrutura interna secundária Evitar complementariedade entre primers Utilizar programa computacional para verificar a especificidade do primer.

Primer-Dimer

Temperatura de anelamento Tm = 4ºC * (#G’s + #C’s) + 2ºC * (#A’s + #T’s) Tanel= Temperatura de anelamento = Tm - 4° C

Concentração de Mg2+

Hot Start Temperatura ambiente Hot start

Aplicações da PCR Análise da expressão gênica. Confirmação de clonagem e transformação Estudos de variabilidade genética Testes de paternidade Análise forense Diagnóstico de doenças virais (Hepatite, HPV, HIV)

Análise da expressão gênica Fator de transcrição liga-se a sequência promotora no gene mRNA Proteína

RT - PCR Isolamento do RNA Quantificação e qualidade Síntese da primeira fita de DNA: Escolha do sistema (1 ou 2 passos) Escolha do primer: Oligo(d)T; hexa/octâmeros; específico RNA-molde: total ou poli-A

RT - PCR • DNA-Polimerase não usa RNA como “template”, Primeiro é necessário fazer a transcrição reversa do RNA em cDNA, RT: Reverse Transcriptase, Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente com a PCR.

RNA total: Quantificação: Qualidade: 1-5% RNA mensageiro 15% RNA transportador 80-85% RNA ribossômico Quantificação: Espectrofotômetro Qualidade: Gel de agarose Razão A260/A280 ~ 1,8-2,0

RT – PCR: 1a Fita de cDNA RNA molde Transcriptase Reversa (AMV ou MuLV) Primer (iniciador) Oligonucleotídeos (dNTPs) Cofator (Mg2+) Tampão

2a fase: amplificação (PCR) RT – PCR: 1a Fita de cDNA Desnaturação do RNA Anelamento do primer Extensão (Transcriptase Reversa) Degradação do RNA (Rnase H) Resfriamento 2a fase: amplificação (PCR)

RT-PCR em gel não é quantitativo!!! Análise semi-quantitativa