Universidade Federal do Piauí – UFPI Campus de Parnaíba Liga Acadêmica Piauiense de Analises Clínicas – LAPAC Evandro Bezerra TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO DE FLUXO LATERAL: UMA FERRAMENTA RÁPIDA DE DIAGNÓSTICO

Introdução Testes Diagnósticos Isolamento e identificação do patógeno Técnicas sorológicas - soroneutralização e ELISA Técnicas moleculares - PCR Testes imunocromatográficos de fluxo lateral SEGURO RÁPIDO EFICAZ

Introdução Testes Imunocromatográficos de Fluxo Lateral 1950 - técnica de aglutinação em látex 1980 - foram estudados e firmados Atualmente - mais de 500 patentes Detecta anticorpos ou antígenos Princípios de biologia, química, física e engenharia

Introdução Vantagens Rapidez no resultado Custo relativamente baixo Produção em alta escala Vida de prateleira longa Independência do uso de outros equipamentos Pequenos volumes de amostras

Componentes do Teste FIGURA 1: Componentes do teste imunocromatográfico de fluxo lateral

Componentes do Teste Filtro de Amostra Distribuição uniforme e controlada para o suporte do conjugado Impede o alagamento do dispositivo Material muito grosso pode reduzir a absorção do líquido Material muito fino pode inundar o interior MALHAS DE ALGODÃO FIBRAS DE CELULOSE FIBRAS DE VIDRO

Componentes do Teste Suporte do Conjugado Transfere uniformemente a amostra sobre a membrana do teste FIBRAS DE VIDRO POLIÉSTER RAYONS FIGURA 1: Componentes do teste imunocromatográfico de fluxo lateral

Componentes do Teste Membrana de Nitrocelulose Região analítica Reagentes de captura na linha teste e linha controle A capilaridade da membrana influência na sensibilidade do teste Antes da montagem final Deposição de proteínas nas linhas teste e controle, Secagem a temperatura elevada Imersão para o bloqueio, com finalidade de evitar a ligações inespecíficas

Componentes do Teste Membrana de Nitrocelulose Região analítica Reagentes de captura na linha teste e linha controle FIGURA 1: Componentes do teste imunocromatográfico de fluxo lateral

CELULOSE DE ALTA DENSIDADE Componentes do Teste Filtro de Adsorção Extremidade distal da membrana de nitrocelulose Suga todo o fluido adicionado no teste Assegura que não ocorra a volta deste material CELULOSE DE ALTA DENSIDADE FIGURA 1: Componentes do teste imunocromatográfico de fluxo lateral

Componentes do Conjugado Nanopartículas de Ouro Coloidal Alta afinidade para proteínas e biomoléculas Permite um fluxo regular através da membrana Mais estável e fácil de usar Entre 2 e 150 nm Partículas maiores, maior a sensibilidade do teste Partículas de Látex colorido Partículas Magnéticas Moléculas Fluorescentes

Componentes do Conjugado Anticorpos Anticorpos monoclonais e policlonais Anticorpos monoclonais - um epítopo do antígeno Anticorpos policlonais - vários epítopos dos antígenos Conferem a sensibilidade e a especificidade de um teste

Peptídeos antimicrobiano Conjugado Nanopartículas de Ouro Coloidal e Anticorpos Depende de fatores como: Estrutura terciária da proteína ph Força iônica Temperatura O ouro também pode ser conjugado com: Antígenos Peptídeos antimicrobiano

Conjugado Nanopartículas de Ouro Coloidal e Anticorpos Os anticorpos são adicionadas com nanopartículas de ouro coloidal Incubadas por algumas horas à temperatura ambiente. Após centrifugação, o pellet é suspenso com um agente estabilizante (albumina de soro bovino e polietilenoglicol)

Formatos de Testes Imunocromatográficos Formato Sanduíche Detecção de anticorpos e também de antígenos. Quando o intuito de detecção é anticorpos: Conjugação de antígenos com partículas de ouro Antígenos não marcados são imobilizados na linha de teste Anticorpos anti-antígeno são imobilizados na linha de controle

Formatos de Testes Imunocromatográficos Formato Sanduíche - detecção de anticorpos

Formatos de Testes Imunocromatográficos Formato Sanduíche Quando o intuito de detecção é anticorpos: Anticorpos anti-antígeno revestidos com partículas de ouro Anticorpo não conjugado presente na linha teste Anticorpos anti-igG na linha controle

Formatos de Testes Imunocromatográficos Formato Sanduíche - detecção de antígenos

Formatos de Testes Imunocromatográficos Formato Indireto para Detecção de Anticorpos Anticorpos anti-igG da espécie pesquisada no teste é conjugado com ouro coloidal Sensibilizados no suporte do conjugado Na linha teste a sensibilização é com antígenos Na linha controle com uma proteína que se ligue ao conjugado.

Formatos de Testes Imunocromatográficos Formato Multiplex Detecta mais de um antígeno ou mais de um anticorpo O antígeno/anticorpo deve estar conjugado e sensibilizado no suporte do conjugado Linhas testes devem conter anticorpos ou antígenos contra os alvos pesquisados Na linha controle deve ocorrer a ligação com o restante do conjugado

Procedimento Testes Imunocromatográficos de Fluxo Lateral

Interpretação Testes Imunocromatográficos de Fluxo Lateral

Aplicação de Testes Imunocromatográficos Diagnóstico de doenças diagnóstico de doenças através da detecção de antígenos ou anticorpos Vírus da Dengue Crytococcus gattii Treponema pallidum Helicobacter pylori Mycobacterium leprae Cryptococcus neoformans

Aplicação de Testes Imunocromatográficos Detecção de Resíduos de Medicamentos Veterinários Legislações e regulamentações em produtos de origem animal Para a detecção de resíduos de medicamentos veterinários em diversas amostras. Exemplos: Ofloxacina em carne de aves e suínos Enrofloxacina em músculos de aves Cloranfenicol no leite

Perspectivas A utilização do reagente de prata Enzimas como marcadores Resultados quantitativos Detecção de mais de um alvo

Considerações Finais Várias técnicas de diagnóstico estão disponíveis Testes que pudessem gerar resultados de forma mais rápida ganhou força a partir de 2006 Aplicações em diversas áreas e com uma variedade de amostras. Otimizar testes com boa sensibilidade e reprodutibilidade

Considerações Finais O aperfeiçoamento no desempenho, qualidade, eficiência e design continuam a ser a chave para a evolução contínua e adoção desta tecnologia.

Universidade Federal do Piauí – UFPI Campus de Parnaíba Liga Acadêmica Piauiense de Analises Clínicas – LAPAC Evandro Bezerra TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO DE FLUXO LATERAL: UMA FERRAMENTA RÁPIDA DE DIAGNÓSTICO Obrigado pela atenção!