Licenciatura em Ciências da Saúde Genética Humana 3º Ano – 1º Semestre 2012-2013

2º Trabalho Laboratorial CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA SENSIBILIDADE AO PTC (feniltiocarbamida) Registo da sensibilidade ao PTC Extracção de DNA genómico a partir de epitélio bucal e sua caracterização Detecção do polimorfismo TAS2R38 por PCR-RFLP Amplificação por PCR da região genómica de interesse Hidrólise do produto de PCR com enzima de restrição Avaliação dos resultados por electroforese em gel de agarose Rastreio de polimorfismos por SSCP Interpretação e integração dos resultados

SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM SSCP A mobilidade electroforética de uma molécula de DNA em cadeia simples num gel desnaturante é função da sua sequência nucleotídica e do seu comprimento. Ambos os parâmetros determinam a forma, o tamanho efectivo e a densidade de carga superficial da molécula de DNA. Assim, torna-se possível distinguir cadeias simples que diferem entre si por apenas um nucleótido

Coloração do gel de poliacrilamida com nitrato de prata sensibilidade superior ao brometo de etídio (1 pg versus 1 ng) Cadeias simples Cadeias duplas

COLORAÇÃO COM NITRATO DE PRATA Os geis de poliacrilamida são impregnados com ião prata solúvel (Ag+) e revelados por tratamento com um agente redutor. As macromoléculas no gel promovem a redução do ião prata a prata metálica (Ag0), a qual é insolúvel e visível, permitindo a visualização de ácidos nucleicos e proteínas contidos nas bandas. A deposição inicial de prata metálica promove a deposição posterior de mais prata metálica, num processo autocatalítico de que resulta uma elevada sensibilidade.

Fixação – tratamento com ácido acético que torna as moléculas insolúveis e impedem a sua difusão para fora do gel durante os passos seguintes. Substâncias que podem interferir com processo de coloração (tampões, iões, desnaturantes, detergentes, anfólitos) são também removidas neste passo. Impregnação com prata – o gel é tratado com nitrato de prata. As condições moderadamente acídicas evitam que o ião Ag seja reduzido a Ag metálica. O gel é lavado com água para remover o excesso de prata da superfície do gel.

Revelação – a solução contém formaldeído que reduz o ião prata a prata metálica. Esta reacção só tem lugar a pH elevado, que é dado pelo bicarbonato de sódio. O tiossulfato de sódio fornece o ião sulfureto (S2-) que reage directamente com a Ag, acelerando e desenvolvendo o processo. O tiossulfato forma também um complexo com o ião Ag livre evitando a sua redução a Ag metálica, o que reduz o “background”. Paragem e preservação – esta solução evita a continuação da redução do ião prata. Além disso contém glicerol que evita que o gel se quebre durante o processo de secagem.

RASTREIO DE MUTAÇÕES Métodos que localizam a zona do gene onde se situa a mutação. Evita a sequenciação de grandes porções de um gene de modo a identificar uma mutação

RASTREIO DE MUTAÇÕES Situações em que se usam estes métodos: Gene isolado e sequenciado, mas poucas mutações identificadas Gene com elevada frequência de alguns alelos mutados, mas nenhum deles foi detectado no doente através de métodos directos Gene com muitos alelos mutados conhecidos, mas todos apresentando uma baixa frequência