Protocolo de Extração de RNA A extração de RNA aqui no laboratório do Amasino é realizada com TRIZOL Todos eles nunca tratam com DNAse, e garantem que não há DNA nas amostras após a extração. Então, lá fui eu fazer a extração com TRIZOL, da maneira que eles recomendam por aqui. Fiz a reação de transcriptase reversa para 3 amostras biológicas de botões florais da planta Arabidopsis (Ler) Fiz o PCR com 4 oligos diferentes, desenhados para amplificar uma região com um intron no meio. Exemplo abaixo: exon1 exon2

Corrida em gel 2% de agarose por 25 min em 7 diferentes temperatura de amplificação usando máquina de PCR gradiente REM22 REM25 55°C 63°C 55°C 63°C REM20 UBQ 55°C 63°C 55°C 63°C Resultado: amplificação de DNA e cDNA das amostras tratadas com TRIZOL. Bem, depois de algumas conversas com o pessoal, verifiquei que, provavelmente, durante a extração de RNA, eles não coletam todo o sobre-nadante e com isso, não recolhem o DNA que fica mergulhado naquela camada branca e/ou próxima dela. Talvez este seja o grande truque durante a extração. Resta testar. Mas, não tive tempo para isso. Talvez, somente em setembro quando tiver mais amostras.

Se você usa as mesmas amostras para fazer real-time, não aparecem duas bandas como é esperado, ou que se houve falar. No meu caso, eu sempre vejo 1 pico de amplificação. Porém, não sei dizer, se é amplificação de DNA ou cDNA. É provavel que seja amplificação de cDNA (com 101pb) (se fosse DNA seria 187pb), já que os oligos são desenhados em exons diferentes e os ciclos são de 15 seg, cada. Mas, não há certeza. O que vocês sugerem? Correr as amostras para ter certeza? Gene sob diferentes diluições H2O

Na tentativa de não ter que semear tudo novamente, esperar o material crescer e extrair, passei para o método de tratar as amostras de RNA com DNAse da promega, conhecida como RQ1. Aquela que também tem no LGMV. Uma dos alunos do Dr. Amasino usa esse tipo de tecnologia e diz funcionar muito bem. Então, lá fui eu fazer novos testes. Peguei as minhas três amostras biológicas e fiz o tratamento com a DNAse da Promega em duplicata. Usei 6ug de RNA, para ter uma boa quantidade no final. Protocolo abaixo: (OBS: fiz tudo em máquina de PCR) Mix: 50 ul de reação 5ul Tampão 10x Xul RNA X ul DNAse (tratar 1ug RNA com 1u DNAse, o que fale diz 1ul de DNA para 1ug de RNA) 1ul RNAsin Plus Dilution Promega(para inibir degradação de RNA) 50ul H2O Incubar as amostras por 30 min a 37°C (Fiz a reação por 35min) Adicionar 5ul Stop Solution, misturar com pipeta e incubar por 65°C por 10min Pronto para uso

Após o tratamento com DNAse, uma etapa importante Após o tratamento com DNAse, uma etapa importante. A limpeza ou purificação do RNA. Nesta etapa, aproveitei que fiz o tratamento em duplicata, e fiz a limpeza da triplicada biológica com o kit da Quiagen usando o conhecido RNeasy mini kit e a outra triplicada com o protocolo caseiro do lab aqui de Madison (Protocolo Madison). Misturar RNA (55ul) com 45ul de H2O Adicionar 14ul KOAc 2.14M, pH5.5 Adicionar 275 ml 100% EtOH, misturar bem com a pipeta Incubar a -20°C por 1 horas Centrifugar por 20 min a temp. ambiente, veloc. Máx. Descartar solução, e lavar 2x com EtOH 70%, centrifugando por 5 min. Secar o material. Eu deixei rapidamente na estufa a 80°C. Adicionar xul de H2O. Após alguns testes, achei melhor ressuspender em 20ul de água para ter uma boa concentração para fazer a RT-PCR.

OBS: Valores medidos no nanodrop OBS: Valores medidos no nanodrop. Neste momento, as amostras foram ressuspendidas em 50ul de H20 Protocolo Madison ng/ul 260/280 260/230 Total de RNA 110.7 2.02 2.04 5.500ng Amostra 1: Amostra 2: 90.2 2.05 2.05 4510ng Amostra 3: 95.1 2.04 2.07 4755ng Qiagen Amostra 1: 66.9 2.10 1.52 3345ng Amostra 2: 74.7 2.17 2.15 3735ng Amostra 3: 79.9 2.13 1.88 3995ng Esses dados indicam que não há tanta perde de material (RNA) e que o protocolo caseiro tem tanta ou mais eficiência do que o kit da Qiagen. Na minha opinião, é bem interessante, pois apenas com o uso de uma única substância (KOAc), o processo pode ficar bem mais barato. Talvez seja uma boa testar aí no lab.

Corrida em gel 2% de agarose por 25 min a 63°C Fiz a reação de transcriptase reversa para as 3 amostras biológicas de botões florais da planta Arabidopsis (Ler) nas duas condições purificadas (Madison e Qiagen=ordem no gel) Corrida em gel 2% de agarose por 25 min a 63°C REM22 –porção final do gene REM25 – porção final do gene UBQ REM22 –porção mediana do gene REM22 –porção inicial do gene REM22 – oligo com junção em diferentes exons REM25 – porção inicial do gene REM25 – ligo com junção em diferentes exons Erro em algum momento Duas bandas se mantêm? Resultado: Para a grande maioria dos oligos testados, houve apenas uma banda amplificada do tamanho de um fragmento de cDNA, indicando que o tratamento funcionou.

Na tentativa de compreender a presença de duas bandas com o oligo da UBQ, fiz um PCR gradiente usando diferentes oligos em diferentes regiões de amplificação do gene para ver o que acontece. (Presente slide e posterior) REM22 – porção mediana do gene REM25 – porção inicial do gene 53°C 55°C 58,2°C 60,2°C 61,9°C 63,2°C 64,1°C 65°C REM25 – oligo com junção em diferentes exons REM21 – porção inicial do gene 53°C 65°C A grande maioria dos oligos funcionaram amplificando apenas 1 banda. Pode-se ver que o oligo REM25, amplificou 2 bandas, indicando um resto de DNA nas amostras com cDNA. Porém, quanto maior a temperatura de amplificação, mais específico é a ligação ao cDNA, amplificando apenas 1 banda.

REM21 – porção mediana do gene REM21 – oligo com junção em diferentes exons 53°C 65°C REM20 – oligo com junção em diferentes exons REM20 – porção inicial do gene DNA A grande maioria dos oligos funcionaram amplificando apenas 1 banda. Pode-se ver que o oligo REM20, amplificou 2 bandas, porém a banda de DNA é bem fraca, indicando um resto de DNA nas amostras com cDNA. Conclusões: Pode-se tratar com DNAse da promega e purificar com protocolo Madison. Mas tentar desenhar oligos com maior especifidade para amplificação de cDNA. De preferência entre um intron de tamanho relativamente grande, e se possível com o oligo entre dois exons próximos.