Ana Luiza Berwanger da Silva Cássia Gomes da Silveira FUNDAÇÃO FACULDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS MÉDICAS DE PORTO ALEGRE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS DISCIPLINA DE GENÉTICA BÁSICA Neurofibromatose tipo 1: do genótipo ao fenótipo Ana Luiza Berwanger da Silva Cássia Gomes da Silveira Melissa Pacheco do Nascimento Tamara Azambuja da Silva Monitora orientadora: Carolina Dutra

INTRODUÇÃO FACOMATOSES Doenças neuroectodermais que envolvem a pele e/ou os olhos, SN e um ou mais sistemas do corpo Peculiaridade: Hamartomas e outros tumores História natural e manejo semelhantes

QUATRO FACOMATOSES CLÁSSICAS NF1 NF2 Genes supressores Esclerose Tuberosa de Tumor Síndrome de von Hippel-Lindau

NEUROFIBROMATOSES Tecidos derivados da Crista Neural 1os afetados Doença de von Recklinghausen Extrema heterogeneidade Nova Clonagem dos genes específicos classificação

HISTÓRICO - Neurofibromatoses Séc.:XIII mais antigo portador de NF: Heinricus (Áustria) 1793 Tilesius: 1a descrição de Tu fibrosos múltiplos da pele “wart man” 1882 Frederich D. von Recklinghausen identificou NF como entidade nosológica individualizada Séc.: XIX Joseph Carey Merrich - “Homem Elefante” 1987 Barker et al. e Sezinger et al. Mapearam os genes da NF1 (cromossomo 17) e da NF2 (cromossomo 22)

NF1 -“Neurofibromatose Periférica ou Doença de von Recklinghausen” Doença autossômica dominante Alto grau de variabilidade da expressão clínica Penetrância 100% Expressividade relacionada à idade

EPIDEMIOLOGIA Distúrbio genético dominante mais freqüente 1:3.000 a 1:5.000 nascidos vivos 50% dos casos representam mutações novas Taxa de mutação para o gene NF1 = 1/10.000 NV

EPIDEMIOLOGIA Mais de 80% das novas mutações são de origem paterna exceto deleções amplas (5%) Não foi estabelecida relação: Idade paterna X Mutações novas

EPIDEMIOLOGIA Idade Prevalência > em jovens  morte precoce dos adultos  subinvestigação dos pacientes com idade mais avançada Incidência mundial Sexo masculino = feminino

EPIDEMIOLOGIA Raça  glioma óptico Raça branca  Tu carcinóide Raça negra Manifestações clínicas  com a idade Taxa de fertilidade é 1/2 valor normal (< homens)

CLÍNICA Expressão clínica variável múltiplos sistemas orgânicos 3 principais manifestações:  Neurofibromas cutâneos 90% dos  Manchas café-com-leite pacientes  Nódulos de Lisch durante a puberdade

CLÍNICA CRESCIMENTO Não há complicações pré-natais 1/3 apresentam retardo de desenvolvimento pós-natal Macrocefalia Puberdade precoce Neurofibromas Alta estatura Plexiformes

CLÍNICA DESENVOLVIMENTO E COMPORTAMENTO Retardo mental (4 a 8%)  grande deleção no gene NF1 ( genes contíguos ? ) Déficit de Aprendizagem  orientação visoespacial  memória a curto prazo

CLÍNICA MANCHAS CAFÉ-COM-LEITE 1ªs manifestações a aparecer  durante os 1ºs 2 anos de vida 0,5 a 50 cm diâmetro Coloração Raça Exposição solar EFÉLIDES

MANCHAS CAFÉ-COM-LEITE EFÉLIDES

CLÍNICA NÓDULOS DE LISCH sinal patognomônico Inofensivos e assintomáticos Infância Exame lâmpada de fenda  com a idade Úteis para confirmação diag. em pctes sem HF

CLÍNICA TUMORES NEUROFIBROMAS  Tu benignos derivados das bainhas nervosas  Disseminados  Idade adulta/progressivos Neurofibromas Dérmicos  cutâneos ou subcutâneos  pequenos e discretos

CLÍNICA  etiologia e patogênese ñ compreendidas  níveis neurofibromina etapa necessária, mas não suficiente Neurofibromas Plexiformes  Tu grandes e amorfos  Início da vida  Propensão à malignidade

NEUROFIBROMAS DÉRMICOS

NEUROFIBROMAS PLEXIFORMES

CLÍNICA TU MALIGNOS PERIFÉRICOS DE BAINHA NERVOSA = neurofibrossarcomas um dos principais tu encontrados 2-4% provêm de N.plexiformes forma agressiva c/ alto índice de Mtx à distância prognóstico pobre

CLÍNICA TU VIA ÓPTICA 2º tu mais comum 15% dos pctes c/ glioma envolvem tu de via óptica 1/2 sintomáticos 1ºs anos da infância não são malignos perda da visão

CLÍNICA LEUCEMIA MIELÓIDE JUVENIL CRÔNICA Associação significativa entre 2 entidades 10% das crianças com LMJC tb possuem NF1 Homens que herdam NF1 das mães > risco Único tipo de Tu, cuja oncôgenese consiste: mutação de inativ. gene NF1 ativação do gene Ras

DIAGNÓSTICO Clínico Dificuldades: variabilidade fenotípica Critérios estabelecidos em 1988 por National Institutes of Health Consensus Development Conference- NIH 2 ou + características são suficientes p/ estabelecer o diagnóstico

DIAGNÓSTICO

DIAGNÓSTICO Considerar idade no momento de aplicar os critérios diagnósticos ! Idade  p/ apresentação clínica Se HF + tendência de diagnosticar parente c/ apenas 1 sinal clínico Exames complementares

NF1

DIAGNÓSTICO MOLECULAR Viável para apenas algumas famílias Análise Direta do DNA diag. pré-natal rastreamento de pré-sintomáticos c/ HF + Estudos de Ligação com Marcadores DNA FISH »»» microdeleções

DIAGNÓSTICO MOLECULAR Protein Truncation Test ( PTT) Rastreamento de mutações do gene NF1, quando o diag. clínico é duvidoso Leucócitos (DNA) Transcrição e tradução in vitro Eletroforese DETECTA: Erros que alteram completamente o produto do gene NF1

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL Recomendado nas gestações c/ um dos progenitores afetados Análise Direta do DNA mutação identificada na família Estudos de Ligação nº razoável de familiares afetados - marcadores conhecidos

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Manifestações Cutâneas (manchas café-com-leite) S. de Russel-Silver S. de Bloom S. de Noonan S. de Watson LEOPARD S. de Sotos e Proteus

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Hamartomas S. de Bannayan-Riley-Ruvalcaba S. de Carney S. de Proteus S. de Maffucci D. de von Hippel-Lindau Polipose adenomatosa familiar

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Neoplasia endócrina múltipla 2B Schwannomatose Lipomatose múltipla Neurofibromatose espinhal familiar »»» neurofibromas para-espinhais Manifestações Esqueléticas S. de McCune-Albright »» pseudo-artrose na NF1

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Síndrome de Noonan ou Síndrome Neurofibromatose-Noonan ? Doença autossômica dominante Manchas café-com-leite S. de Noonan clássica Manifestações da S. de Noonan variabilidade de NF1 clássica ?

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Neurofibromatose tipo 2

ASPECTOS MOLECULARES A estrutura do gene NF1 1987 Mapeado na r. pericentromérica do braço longo do cromossomo 17 (estudo de ligação) 1990 Isolado pela primeira vez (clonagem posicional) Recentemente Seqüenciado inteiramente e localizado na r. proximal de 17q (17q11.2)

GENE NF1 Compreende mais de 350 kb de DNA Região cromossômica 17q11.2 Codifica um RNAm de 11-13 kb Contém, no mínimo, 59 éxons

CROMOSSOMO 17

GENES DENTRO DE GENES Pseudogene AK3 3 genes contidos em um dos íntrons do gene NF1 (íntron 27) EVI2A, EVI2B, OMGP Pseudogene AK3 Transcrição ocorre no sentido oposto à do gene NF1 (3´ 5´) Mecanismo envolvido na gênese da NF1?

GENES DENTRO DE GENES Evento fisiológico normal ! Transcrição  Transcrição EVI2A, gene NF1 EVI2B, OMGP (5´ 3´) (3´ 5´) Eventos independentes que ocorrem em momentos diferentes !

GENES DENTRO DO GENE NF1

GENES DENTRO DE GENES Contribuição incerta na gênese da doença. Função das proteínas codificadas por esses genes, as quais diferem da neurofibromina, permanecem desconhecidas até o momento.

GENES DENTRO DE GENES Contribuição na variabilidade de expressão da síndrome? Gene EVI2A cérebro, m. óssea, céls. sangue Gene EVI2B m. óssea, céls. sangüíneas Gene OMGP codificador da glicoproteína mielina dos oligodendrócitos (OMGP), expressa somente nos oligodendrócitos do SNC.

ASPECTOS MOLECULARES Origem distinta dos tecidos afetados clinicamente Hipóteses: Não se conhecem as funções dos produtos dos 3 genes contidos no gene NF1 Apenas 10% da neurofibromina possuem função conhecida

SPLICING ALTERNATIVO Splicing remoção de íntrons presentes em meio a regiões codificadoras de genes eucarióticos, gerando um RNAm maduro, que pode ser traduzido em uma proteína funcional. Formas alternativas de splicing remoção de éxons e/ou permanência de íntrons. Isoformas do produto do gene NF1 = proteínas muito similares entre si NEUROFIBROMINA

SPLICING ALTERNATIVO GRD II no éxon 23a da NF1-GRD 4 formas alternativas de splicing: GRD II no éxon 23a da NF1-GRD 3´ALT no éxon 48a da terminação 3´ 5´ALT1 no éxon 9 5´ALT2 Isoforma específica dos neurônios, contendo o éxon 9a restrita aos neurônios do cérebro, hipocampo, tálamo e corpo estriado

EXPRESSÃO DO GENE NF1 NF1 se expressa em muitos tecidos do corpo Neurofibromina detectada: cérebro, rim, fibroblastos da pele, leucócitos, baço, pulmão, músculos melanoma, neuroblastoma, timoma, neurofibroma, neurofibrossarcoma, ca cólon e pulmão As células que mais expressam as mutações do gene NF1 são aparentemente derivadas da crista neural.

O PRODUTO DO GENE NF1 = A NEUROFIBROMINA Gene NF1 codificador de uma proteína análoga à Ras-GAP (proteína de ativação GTPase) NEUROFIBROMINA Peptídeo intracitoplasmático de 240 kDa, com 2818 aminoácidos

O PRODUTO DO GENE NF1 = A NEUROFIBROMINA Promove a hidrólise intrínseca da GTP ligada à Ras Põe fim à sinalização intracitoplasmática da proliferação celular Regulador negativo da via de transdução de sinal mediada pela Ras MUTAÇÕES INATIVAÇÃO GENE NF1 SINALIZAÇÃO Ras CRESC. CELULAR

VIA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL

NEUROFIBROMINA Inativação análoga à família de proteínas GAP Fosforilação em resíduos de serina e treonina Resposta ao estímulo de fatores de crescimento Via de transdução de sinal (crescimento celular)

NEUROFIBROMINA Três outros possíveis mecanismos de controle do cresc. e diferenciação cel.: Regulação  da região upstream do gene Ras Atividade efetora da r. downstream do gene Ras “Ponte” entre a tubulina e o gene Ras

NEUROFIBROMINA E TUBULINA Localizada próxima aos microtúbulos Associação a elementos do citoesqueleto Estruturação dos microtúbulos mecan. dependente de GTP Controle ligação da tubulina ao GTP análogo ao controle da fosforilação da Ras Proteínas GTPase

NEUROFIBROMINA E TUBULINA Neurofibromina atua como uma proteína GAP nas alterações da citoarquitetura da cél. em resposta aos fatores de crescimento Tubulina papel inibidor da ação da enzima GTPase Interação tubulina/neurofibromina = “ponte” entre tubulina e proteína Ras

NEUROFIBROMINA Apenas 10% da molécula delineada Domínio relacionado a GAP (NF1-GRD) região de 360 aa, do éxon 21 ao 27, c/ homologia ao domínio catalítico da família de prot. GAP Função supressora de tumor Insuficiência da neurofibromina, porém, pode não estar envolvida somente na tumorigênese, mas também na geração das outras manif. clínicas Mutações gene NF1 inativação neurofibromina células haplo-insuficientes

NEUROFIBROMINA Em suma, a patogênese da NF1 ainda não é completamente conhecida Fenótipo tu provavelmente resulta da regulação anormal da sinalização da Ras Outras manifestações clínicas não são facilmente explicadas pela interação neurofibromina - Ras

PADRÃO DE HERANÇA Condição autossômica dominante Fenótipo aparece em todas as gerações; Toda pessoa afetada tem um genitor afetado; Qualquer filho de genitor afetado tem um risco de 50% de herdar o caráter; Familiares fenotipicamente normais não transmitem o fenótipo para seus filhos; Homens e mulheres têm a mesma probabilidade de transmitir o fenótipo aos filhos de ambos os sexos. 50% pctes. NF1 não possuem HF+ ALTA TAXA MUTACIONAL DO GENE NF1 !!!

TUMORIGÊNESE Hipótese de Knudson

TUMORIGÊNESE As diferenças entre os mecanismos de tumorigênese do neurofibroma cutâneo e do neurofibroma plexiforme ainda são incertas.

TUMORIGÊNESE Os mecanismos reais da tumorigênese em que a NF1 está envolvida permanecem desconhecidos. Necessidade de um segundo evento mutacional Métodos incapazes de detectar peq. mutações Mutação em outro gene supressor de tumor Mutação no gene Ras Mutação em outro gene

MUTAÇÕES As causas para a alta taxa mutacional do gene NF1 ainda não são conhecidas, embora muitas explicações tenham sido propostas. Tamanho do gene; Presença de seqüências de bases repetidas; Dinucleotídios CpG; Existência de loci relacionados ao gene NF1 nos cromossomos 2, 12, 14, 15, 20, 21 e 22.

MUTAÇÕES Aproximadamente 50% dos casos de NF1 são resultantes de mutações novas e, destas, 80% são de origem paterna.

TIPOS DE MUTAÇÕES

MUTAÇÕES Aproximadamente 82% das mutações específicas do gene NF1 totalmente caracterizadas correspondem a mutações nonsense e frameshift. Ainda não foram descritos pontos quentes mutacionais em NF1.

MUTAÇÕES Hipóteses: Sensibilidade das técnicas disponíveis; Regiões ainda não rastreadas.

MOSAICISMO Mosaicismo e doença generalizada; Mosaicismo gonadal; Mosaicismo segmentar;

RELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO Ainda não há correlação estabelecida entre a região mutada do gene NF1 e o fenótipo dos pacientes portadores dessa síndrome. Até o presente, não se encontrou uma relação clara entre o tamanho da mutação e as características clínicas apresentadas pelos pacientes portadores dessa síndrome.

EXPRESSIVIDADE A expressividade variável é uma das características mais marcantes da NF1. Eventos rândomicos adicionais particulares de cada paciente; Fatores epistáticos; Mosaicismo Somático; Fatores Ambientais.

EXPRESSIVIDADE Neurofibromatose Segmentar

MANEJO Tratamento definitivo ainda não foi estabelecido Conduta atual:  aconselhamento genético  detecção precoce das complicações

MANEJO

MANEJO 1) História do pcte. e familiares c/ caract. NF1 Conduta: 1) História do pcte. e familiares c/ caract. NF1 2) Ex. clínico princ.da pele, esqueleto e Sist. Nervoso 3) Avaliação oftalmológica 4) Avaliação do desenvolvimento neuromotor em crianças 5) Outros estudos c/ base na clínica

MANEJO Rotina de acompanhamento: 1) Consulta anual do paciente 2) Exame oftalmológico 3) Avaliação do desenvolvimento na criança 4) Monitorização regular da pressão arterial

TRATAMENTOS ESPECÍFICOS Problemas de crescimento Desenvolvimento e comportamento Manchas café-com-leite Tumores

TRATAMENTO ESPECÍFICO DOS TUMORES  Cirúrgico  Embolização / inibidores da angiogênese  Quimioterápicos Proteína Ras citoplasma Grupo lipídico farnesil Associação Ras membrana

TRATAMENTO ESPECÍFICO Futuro tto tumores:  Imunologia  Vacinas  Anticorpos + quimioterapia

TRATAMENTO ESPECÍFICO Pacientes mosaicos: ausência de manejo padronizado Terapia gênica : (dificuldades)  correção alelo mutante NF1  acometimento de múltiplos tecidos  modelos animais

PROGNÓSTICO Pacientes com NF1 apresentam expectativa de vida igual à da população em geral. Complicações aparecem precocemente. Gliomas e tumores da bainha de nervos periféricos de baixo grau possuem prognóstico favorável.

ACONSELHAMENTO GENÉTICO Natureza, herança e complicações da NF1 Herança com padrão autossômico dominante  somente em casos de mutação herdada Mosaicismo gonadal 50% apresentam mutação nova

CONCLUSÃO NF1 apresenta-se como uma doença complexa A aplicação de técnicas recentes (PTT) essencial para pesquisas futuras Funções para os genes EVI2A, EVI2B e OMGP Neurofibromina / gene Ras / tubulina

THE END!