Extração de DNA e RNA Enzimas de Restrição Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Ciências Biológicas Laboratório de Polimorfismos Genéticos Extração de DNA e RNA Enzimas de Restrição

Coleta de material biológico: Várias fontes de material biológico. Todos os tecidos de todos os organismos. Quando? De quem? Como? Tratamentos? Quanto mais fresco melhor! Quantidade aceitável Boa conservação EPI! Contenção!

Extração de DNA

De onde podemos extrair DNA? 1. Extração de DNA De onde podemos extrair DNA? Sangue Tecidos Células de cultura Extração plasmídeos de células bacterianas Purificação de DNA de gel ...

Sangue total 1. Extração de DNA Material de pacientes e controles - Lapoge Sangue total Buffy coats Amostras de tecido

Objetivos? Integridade Pureza Quantidade 1. Extração de DNA Objetivos PCR – tamanho? Integridade Pureza Quantidade Genotipagem? Sequenciamento? Quantificação de RNA - Expressão?

Fundamentos 1. Extração de DNA Lisar eritrócitos (choque osmótico) Lisar leucócitos (detergentes) Inativar DNAse (quelante -EDTA) Precipitar/degradar proteínas (sais/proteinase) Precipitar DNA (etanol) Reidratação do DNA em água ou tampão

Principais Métodos Fenol-Cloróformio Salting-out Kits com colunas 1. Extração de DNA Principais Métodos Fenol-Cloróformio Salting-out Kits com colunas

Fenol-Cloróformio 1. Extração de DNA Lise I: eritrócitos Lise II: leucócitos Fenol-clorofórmio Precipitação etanol

1. Extração de DNA Contaminação da amostra por fenol Reagentes tóxicos! Barato Simples Boa quantidade Boa qualidade Estabilidade do DNA

Salting-out 1. Extração de DNA http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002

1. Extração de DNA Estabilidade do DNA? Sais contaminantes Barato Simples Boa quantidade Boa qualidade Não tóxico

1. Extração de DNA Kits

1. Extração de DNA Caro Estabilidade do DNA MUITO Simples Boa quantidade Boa qualidade Não tóxico

TRIzol RNAlater Kit com colunas Extração de RNA: Análises de expressão Similar a extração de DNA Protocolo bem mais cuidadoso Molécula muito mais instável Amostra pode ser bem conservado em TRIzol, RNAlater, etc.) - snapshot É preciso separá-la do DNA Melhorar essa parte! TRIzol RNAlater Kit com colunas

TRIzol 2. Extração de RNA Lise I: eritrócitos TRIzol (fenol-guanidina) Clorofórmio Precipitação etanol Pode ser usado para extração de RNA, DNA e Proteínas!

Kit com colunas

Transcrição reversa

(Nanodrop) (Quebit)

Espectrofotômetro - Nanodrop 260/230 ~1,8 260/230 ~2,0 260nm – DNA/RNA 280nm – proteína, fenol,.. 230nm – contaminantes (carboidratos, fenol,..)

Armazenar? Estoque Uso (diluído) DNA: -20◦C RNA: -80◦C

Enzimas de restrição

Enzima de restrição: Endonucleases produzidas por bactérias para se defender de vírus. Quebram o DNA em fragmentos menores, não infecciosos. Reconhecem sítios específicos (sítios de restrição) no genoma e a corta. São conhecidos mais de 3000 enzimas

Enzima de restrição: tipos de clivagem Fragmentação DNA! Clonagem! Genotipagem! ...

Enzima de restrição: Detecção de SNPs RFPL: Polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição Detecção dos polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs – single nucleotide polymorphisms). Os primers utilizados na PCR flanqueiam a região que contém, ou não, o sítio de clivagem reconhecido pela enzima de restrição utilizada. O produto da PCR é posteriormente submetido à ação da enzima de restrição.

Enzima de restrição: como ocorre a clivagem

Enzima de restrição: resultado da restrição 3´ CGTAAATCTATACGAGAATTCACGTACGTA5´ 5´ GCATTTAGATATGCTCTTAAGTGCATGCAT3´ 3´ CGTAAATCTATACGAGTATTCACGTACGTA5´ 5´ GCATTTAGATATGCTCATAAGTGCATGCAT3´ 2 1 2/2 1/2 1/1