OPTICON Continuous Fluorescence Detection System Químicas e Aplicações OPTICON Continuous Fluorescence Detection System 3/25/2017

Principais Químicas SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan 3/25/2017

Revisão Como funcionam essas químicas Em que etapa da reação o sinal é visto: Denaturação, Anelamento, Extenção Aplicações para cada química 3/25/2017

SYBR Green 1 3/25/2017

Como funciona? Liga-se ao dsDNA SYBR Green 1 fluoresce quando na presença de dsDNA G T C A

Desnaturação: Não emite Sinal G T C A SYBR Green 1 não ligado DNA denaturado

Annelamento dos Primers: Fluorescência G T C A

Extenção: Fluorescência Ponto de leitura G T C A SYBR Green 1 ligado ao dsDNA

Análise Quantificação da concentração inicial do Template: SIM Análise de Curvas de Melting: SIM; verificação de produtos únicos, variantes, produtos múltiplos e/ou complexos primer dimer Análise de End Point SIM; Leitura realizada após terminada a amplificação

Quantificação de concentração inicial de Template Maior concentração inicial de DNA, menor número de ciclos necessário para detecção. Usa-se comparação de Controles de DNA contra amostras desconhecidas e obten-se um gráfico. Desconhecido Controle Intensidade de Fluorescência Controle C(T) Número de Ciclos Número de Ciclos 105

Análise de Curva de Melting Identificação do produto por Tm Intensidade de Fluorescência Tm Temperatura

Análise de Curva de Melting Produto não específico Produto de interesse -dI/dT Intensidade de Fluorescência Temperatura Identificação do Produto por perfil térmico, tm - Tm de cada amostra difere pela concentração de GC e pelo comprimento

Vantagens do SYBR Green 1 Fácil de usar - Não utiliza probes de difícil desenho Não é sequência-específico - Pode ser usado para diferentes templates Baixo custo Sensível 3/25/2017

Desvantagens SYBR Green 1 Ligação a produtos não-específicos Pode inibir a reação à altas concentrações Solução: sistema mais sensível 3/25/2017

Molecular Beacons 3/25/2017

Como funciona? Probe em forma de alça (hairpin) Fluoróforo absorvido por um quencher O loop é complementar a sequência alvo Stem é composto de sequências complementares

Denaturação: Fluorescência Não-específica

Anelamento: Fluorescência Ponto de Leitura Sequência alvo Stem Loop Fluoróforo Quencher Probe hibridizado

Extenção: Sem Fluorescência Probes não ligados

Aplicações Quantificação de Detecção de sequências específicas. Deteção de Single Nucleotide Polymorphisms - Sistemas de detecção simples requerem corrida em duplicata

Vantagens Alta epecificidade de detecção - Melhor técnica para detecção de SNP Pode ter custo reduzido quando utilizado para screening do mesmo Target Permite escolha do Fluoróforo

Desvantagens Design complicado Específico para um Target Custo elevado

TaqMan 3/25/2017

Como funciona? Probe Target-específico 5’ Reporter and 3’ Quencher Complementar a sequência alvo

Denaturação: Sem Fluorescência Sem Hibiridização 5’ 3’ 5’ 3’

Anelamento: Sem Fluorescência Hibridização do Probe 3’ 5’ 3’ 5’

Extenção: Polimerização 3’ 5’ 5’ 3’ Não ocorre extensão do probe 3’

Extensão: Strand Displacement 3’ 5’ 5’ 3’ Probe desligado no 5’ Reporter pela Taq Polymerase

Extenção: Clivagem e Fluorescência 3’ 5’ 5’ 3’ Probe clivado via atividade exonuclease 5’-3’ Taq polymerase.

Análise Curva de Melting: NÃO Não é possível análise de Curva de Melting devido as propriedades do probe Quantificação de concentração inicial de Quantify Template: SIM Análise de End point: SIM

Aplicações Deteção e Quantificação de amostras específicas. Deteção de Single Nucleotide Polymorphisms - Sistemas de detecção simples requerem corrida dupla

Vantagens Alta específicidade - Bom para detecção de SNP Design menos complicado que Molecular Beacons Custo reduzido quando utilizado para o mesmo Target Livre escolha do Fluoróforo 5’

Desvantagens Desenhado especificamente para um target Não permite análise de Curvas de melting

Resumo Química Como Funciona Quencher Detecção do Sinal Principal aplicação SYBR Green I Liga-se a menor curva do dsDNA Não Qualquer etapa Quantificação e Detecção. Análise de Curvas de Melting Molecular Beacons Probe Hibridização (Hairpin) Sim Anelamento Detecção de SNP Quantificação e Detecção TaqMan Probe Hibridização (5’-3’ Exo) Extenção

Real Time PCR DNA Engine OPTICOM 3/25/2017

DNA Engine Opticon Especificações: Exitação e detecção Solid state Capacidade de 96 amostras Single color Dynamic range: 7 Ordens de magnitude Upgradeable Baseado na plataforma PTC-200 Windows NT 3/25/2017

DNA Engine Opticon Melhor: Extremamente sensível <5nM Fluorescein Grande dynamic range Baseado em tecnologia já existente Não utiliza partes móveis Pequeno tamanho Upgradeable Gradiente Baixo custo: $35,000 3/25/2017

3/25/2017

Technologia 96 LEDs focados em cada poço/amostra Cada Poço é exitado individualmente(450-495nm) Detectado por PMT (515-545nm) Exelente para SYBR Green e FAM 3/25/2017

Opticon™ Opticon™ Plataforma DNA Engine™ Unidade Alpha™ 96V Torre Opticon

Plataforma PTC 200 DNA Engine™ Tecnologia de Ponta Referência em termocicladores

Unidade Alpha™96V Placas ou Tubos Tampas chatas ou filme

Torre Opticon™ Light Emitting Diode (LED) Array Uso de Fotomultiplicador (PMT) Lentes Fresnel

LED Array

Fotomultiplicador PMT

Lentes Fresnel

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Opticon™ Baseado em Tecnologia de ponta – PTC 200 Plataforma completa – acompanha computador Design simples – ocupa pequeno espaço Alta sensibilidade – capta < 5nM Fluorescein Manutenção com menor custo Menor preço Assistência técnica já presente no Brasil 3/25/2017