Hibridização in situ Yvana Cristina Jorge Profª. Drª. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira Elementos de Microscopia e Microanálise

Usada pela 1ª vez no mapeamento físico de genes Técnica de Hibridização in situ Permite a detecção de sequências de DNA e RNA em preparações citológicas e cortes histológicos Usada pela 1ª vez no mapeamento físico de genes Gall e Pardue (1969): sondas de RNA ribossomal

As sondas são sequências de nucleotídeos complementares desenvolvidas a partir de segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identificar  ISH As sondas podem estar associadas a moléculas radioativas, fluorescentes ou biotiniladas

Suporte sólido, em soluções Tipos de hibridização In vitro Suporte sólido, em soluções Southern blotting – DNA Northern blotting - RNA In situ Tecidos e preparações citológicas

Princípios Sensibilidade: depende do acesso da sonda ao material-alvo. Resolução: depende do diâmetro celular e do método usado para marcação e detecção da sonda. Especificidade: depende da estringência da lavagem e da extensão similar entre a sonda e a sequência-alvo. Segurança: sondas não-radioativas são mais seguras que as radioativas.

Etapas da Hibridização in situ Preparação da sonda Sondas de DNA dupla cadeia: podem ser sintetizadas por nick translation, random priming ou PCR na presença de nt marcados. Sondas de DNA cadeia única: sintetizadas por PCR. Sondas de oligonucleotídeos: ocorre com a incorporação de nt marcados. Sondas de RNA: uso de RNA polimerase purificada que transcreve determinadas sequências a partir de um sítio de iniciação. Geralmente essa sonda é clonada usando-se um plasmídeo.

Preparação da sonda Comprimento da sonda: Sondas muito longas podem formar sinais fracos devido a baixa taxa de penetração. 50 a 150 pb resultam, geralmente, em bons sinais. Marcação da sonda: Marcação radioativa: eficiência da síntese pode ser monitorada; radioisótopos são facilmente incorporados durante a síntese (H3, P32 e S35).

Marcação não radioativa: rapidez na visualização, alta estabilidade da sonda, segurança, melhor preservação da morfologia do tecido, facilidade de execução, menor custo e desperdício. Interação entre biotina-avidina ou com algum anticorpo, sendo que alguns fluorocromos (Fluoresceína ou rodamina) podem ser usados para identificar sítios de hibridização.

2.Preparação do material: essa etapa é variável porque depende da natureza do material e do tamanho e tipo de sonda a ser utilizada. Cultura de tecidos: as células devem crescer diretamente sobre as lâminas ou as células devem ser pingadas. Fixação: deve ser suficiente para prevenir a perda do ácido nucléico (paraformaldeído 4% e glutaraldeído 4%). Embebição e seccionamento: o pedaço de tecido pode ser congelado ou embebido em parafina. Importante para a preservação do tecido.

3. Pré-tratamento: Essa etapa é necessária para aumentar a eficiência da hibridização e/ou diminuição da formação de ligações não-específicas. Se a sonda for cadeia dupla, ela deve ser denaturada a 70ºC em formamida. Pepsina RNAse Ácido acético

4. Hibridização: para cada caso se tem um protocolo. 5. Lavagem pós-hibridização: para remoção do excesso de sonda. 6. Detecção da sonda: depende do tipo de marcação incorporada na sonda: Radioativa Autoradiografia Não-radioativa Direta Indireta

Fosfatase alcalina ou peroxidase IgG conjugada a Fluoresceína Direta Indireta A sequencia é marcada com biotina que é detectada pela ligação com a avidina. Depois, utiliza-se uma enzima ou fluorocromo para a visualização. A sonda é marcada com biotina e, utiliza-se uma anticorpo anti-biotina. Após, usa-se um anticorpo secundário. Policlonal de cabra Fosfatase alcalina ou peroxidase IgG conjugada a Fluoresceína Fluoresceína ou Rodamina

Artefatos da técnica Background (sondas radioativas): preparação inadequada da emulsão e o posicionamento da lamínula. Background (sondas não-radioativas): ligações não específicas. Hibridização não eficiente: degradação da sequencia-alvo; tamanho e/ou concentração baixa da sonda; estringência da hibridização ou lavagem; tipo de tratamento e fixação.

FISH

Uniram a técnica de hibridização com imunofluorescência Pinkel et al. 1986 Uniram a técnica de hibridização com imunofluorescência Pinkel et al. FISH Usa corantes fluorescentes ligados a sonda Aplicações Aberrações cromossômicas Mutagênese Diagnóstico de câncer Pré-natal e pré-implantação

3 categorias de sondas: Sondas que hibridizam locus específicos ou sequências únicas: -Sequências únicas de DNA amplificado por PCR ou vetores biológicos. -Resultam em sinais discretos em cromátides irmãs de metáfases e dois sinais no núcleo interfásico. 2. Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas: -Sondas pericentroméricas específicas ou sequencias repetitivas alfa-satélite, beta-satélite e sondas de satélites clássicos e, sondas teloméricas -Sinal nítido e brilhante

3. Sondas que hibridizam sequências cromossômicas múltiplas: -Coquetel de sequências únicas homólogas a sequências de DNA abrangendo o comprimento de uma banda ou cromossomo alvo. -Seu uso em núcleos interfásicos é limitado pela ausência de um sinal distinto.

Sondas centroméricas

Sonda de sequência única

FISH aplicado ao diagnóstico

Verde: cr. 17 Laranja: Her-2

1q41 1q43

M-FISH

Hibridização in situ Fluorescente Multialvo Possibilita a visualização de várias sequências diferentes simultaneamente em cromossomos metafásicos e núcleos interfásicos. Várias sondas complementares à diferentes sequencias-alvo numa mesma hibridização. Aplicações Citogenética do câncer Determinação sexual

Sonda painting

CGH

Hibridização Genômica Comparativa Identificação de anomalias cromossômicas e de sequências amplificadas e deficientes. Permite a análise em todo o genoma de uma só vez. --Alterações genéticas complexas e aneuploidias em tumores; --Translocações e inversões específicas em certos tipos de leucemia.

O DNA genômico de interesse e o DNA normal são cortados pelas mesmas enzimas de restrição e marcados de forma a serem detectados por fluorocromos diferentes. Numa proporção de 1:1, os DNAs são co-hibridizados sobre uma lâmina com métafases de tecido normal. A visualização dos diferentes sinais permite a comparação entre os DNAs em relação às metáfases normais, fornecendo um número comparativo de aumento ou perda de DNA: Oncogenes Genes supressores

Metáfase normal DNA teste DNA controle Hibridização

CHROMOSOME PAINTING

1 ou mais cromossomos inteiros Marcação 1 ou mais cromossomos inteiros Vários tipos de fluorocromos Metáfase Detecção de alterações cromossômicas Rearranjos complexos Diagnóstico pré-natal Estudos de evolução comparativa

SKY

Cariotipagem espectral 1996 Schrock et al. Cromossomos humanos

Cariotipagem espectral Permite a identificação de todos os cromossomos inteiros com diferentes cores. Necessita de uso combinado da espectroscopia de Fourier, analisador de imagens e microscópio óptico. Usa simultaneamente 24 diferentes sondas marcadas com nt conjugados a 5 tipos de fluorocromos: Cy2 SG Cy3 TR Cy5

Identificação de alterações cromossômicas O computador processa uma determinada cor para cada par cromossômico, facilitando a interpretação. Aplicações Identificação de alterações cromossômicas Rearranjos estruturais Cromossomos marcadores Genética Clínica Genética do Câncer Biologia evolutiva e comparativa

Obrigad