Influência da espécie de triatomíneo na seleção de subpopulações em infecções mistas de Trypanosoma cruzi Renato Santana de Aguiar Orientadora: Profa. Andréa Mara Macedo Co-orientador: Prof. Sérgio Danilo Pena Colaboração: Prof. Egler Chiari Laboratório de Genética Bioquímica Laboratório de Biologia do Trypanosoma cruzi

A DESCOBERTA Flagelados sangüíneos 1909 P. megistus

PREVALÊNCIA E TRANSMISSÃO Modos de Transmissão Vetorial: 80% Transfusional: 17% Congênita: 2% Outros: 1%

? INFECÇÃO HUMANA FASE AGUDA FASE CRÔNICA Sinal de Romanã Cardíaca Digestiva Indeterminada

A doença de Chagas Fase crônica:  indeterminada  cardíaca  digestiva  cardio-digestiva indeterminada cardíaca digestiva cardio-digestiva Dias, 1985

Ciclos de transmissão Ciclo doméstico Ciclo silvestre

Vetores e reservatórios Principais vetores Triatoma infestans Triatoma brasiliensis Panstrongylus megistus Triatoma pseudomaculata Triatoma sordida Principais reservatórios marsupiais desdentados roedores carnívoros lagomorfos primatas

Biológica Variedade Populacional de T. cruzi Morfologia Virulência/patogenicidade Cinética de crescimento Susceptibilidade à drogas Constituição antigênica Propriedades imunológicas Infectividade em céls. hospd. 1909

Gambás e triatomíneos silvestres Z1  Z2  Z3  Protéico Isoenzimas Humanos Amazônia Esquizodema kDNA Grupo 1 - ciclo doméstico Grupo 2 - ciclo silvestre rRNA Mini-exon DNA nuclear

Simpósio Internacional Comemorativo dos 90 anos da Descoberta da Doença de Chagas Rio de Janeiro, 1999 Zimodema 1 (Miles e cols., 1977) Ribodemas II/III (Clark & Pung, 1994) Grupo 2 do rRNA (Souto e cols., 1996) T. cruzi I T. cruzi II T. cruzi Zimodema 2 (Miles e cols., 1977) Ribodemas I (Clark & Pung, 1994) Grupo 1 do rRNA (Souto e cols., 1996) Cepas sem caracterização ou inconclusivas

A doença de Chagas

? REDUÇÃO POPULACIONAL PARASITAS INFECÇÃO PARA ANÁLISE POLICLONAL MOLECULAR INFECÇÃO POLICLONAL ? REDUÇÃO POPULACIONAL ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DE PARASITAS in vitro

Microssatélites de DNA Taxa de mutação: 10-3 a 10-5 Dispersos em todo o genoma Altamente polimórficos AT CCG CA

Replicação do DNA Alça na fita molde Alça na fita nascente Inserção GT Replicação do DNA Alça na fita molde Alça na fita nascente Inserção Deleção

Microssatélites de repetição (CA)n no genoma de T. cruzi

Amplificação de microssatélites (PCR) alelo A alelo B alelo C AA AB AC BB BC CC Amplificação de microssatélites (PCR)

Avaliar a influência de espécies de triatomíneos provenientes de diferentes ecótopos na seleção de sub-populações em infecções mistas de T. cruzi, através da amplificação de microssatélites de DNA diretamente das fezes de triatomíneos infectados.

ESTABILIDADE DOS MICROSSATÉLITES

Cultivo de 70 gerações do clone CL Brener Parental 10a geração 20a geração 30a geração 40a geração 50a geração 60a geração 70a geração Amplificação por PCR Locos: SCLE10, SCLE11, MCLE01, MCL03, MCL05, MCLE08, MCLG10 e MCLF10

Detecção de polimorfismos de microssatélites PCR ALF LASER

Eletrofluorograma das 70 gerações do clone CL Brener MCLG10 MCL05 parental parental 10a 10a 20a 20a 30a 30a 40a 40a 50a 50a 60a 60a 70a 70a

Estabilidade dos microssatélites de T. cruzi

Conclusões Os microssatélites de repetição (CA)n dos locos: SCLE10, SCLE11, MCLE01, MCL03, MCL05, MCLE08, MCLF10 e MCLG10 do clone CL Brener de T. cruzi não se alteraram nas 70 gerações avaliadas. Os microssatélites de repetição (CA)n do genoma de T. cruzi são altamente estáveis em condições laboratoriais, sendo portanto, bons marcadores genéticos a serem utilizados nas infecções experimentais em triatomíneos.

ESTUDOS POPULACIONAIS DE ISOLADOS NATURAIS DE T. cruzi

Isolados naturais de T. cruzi Mico leão dourado (3) Gambá (1) Humanos (6) Humanos (3) Triatomíneos (8) Gambá (2) Silvestres:14 Domésticos:14 Humanos (5)

Locos de microssatélites amplificados Metodologia SCLE10 SCLE11 MCLE01 MCLF10 MCLG10 Locos de microssatélites amplificados Eletroforese em seqüenciador automático de DNA ALF

Perfis de amplificações B C D MCLE01 A e B (200 pm e Ig 62 / humano)  monoclonais C e D ( RB VII, RB III / Rhodnius brethesi)  multiclonais

triatomíneos silvestres Infecções mistas em triatomímeos Reservatórios Número de cepas Monoclonal Multiclonal Total triatomíneos silvestres 3 (37,5%) 5 (62,5%) 8 mamíferos silvestres 6 (100 %) - 6 humanos 12 (85,7%) 2 (14,3%) 14 total 21 (75%) 7 (25%) 28

RBII, RBIII, RBVII, RB VIII, RB X, JJ/AM e AM16 Cepas multiclonais RBII, RBIII, RBVII, RB VIII, RB X, JJ/AM e AM16 Coura e cols., 1994

LOCOS DE MICROSSATÉLITES SCLE10 SCLE11 MCLE01 MCLF10 MCLG10 CEPAS pb

Caracterização da região 3’ do gene 24S rRNA Gene rRNA 24Sa 5’ 3’ A B C 125 bp - 110 bp - Grupo 1 Grupo 1/2 Grupo 2

Rede de Wagner Método da Máxima Parcimônia 20 cepas de T. cruzi CPI 95/94 200pm CPI 103894 CPI 11/94 PFPI 58/94 OPS 27/94 Ig539 Ig62 803 GLT593 GLT564 1931 84Ti 1523 1502 D7 RBIX RBVI GLT600 RBI 100 93 95 81 Rede de Wagner Método da Máxima Parcimônia 20 cepas de T. cruzi Grupo 2 rRNA 24S Grupo 1 rRNA 24S LEGENDA 1

Evidências da clonalidade de T. cruzi Cálculo da heterozigosidade (GENETIX, H = 1 - Xi2) Desvio de equilíbrio de Hardy-Weinberg Loco no de alelos Variação dos alelos (pb) Heterozigosidade esperada Heterozigosidade observada MCLE01 12 122-154 0.8481 0.7143 MCLF10 7 180-192 0.7732 0.2381 MCLG10 8 152-182 0.8039 0.4286 SCLE10 13 247-291 0.8900 0.6190 SCLE11 9 139-157 0.5238

Conclusões Os microsstélites de repetição (CA)n são ferramentas poderosas na avaliação da clonalidade de uma cepa de T. cruzi. Os maiores índices de infecções mistas foram encontrados em isolados naturais de triatomíneos silvestres. A maioria dos isolados naturais de pacientes chagásicos são constituídos de apenas uma população de T. cruzi.

Conclusões Os microssatélites foram capazes de separar os isolados naturais de T. cruzi em dois grupos, fortemente correlacionados com as tipagens realizadas pelo gene do rRNA. A separação entre os grupos de T. cruzi proposta pelos microssatélites pode ser também correlacionada com os ciclos silvestre e doméstico dos parasitas, exceções feitas às amostras isoladas de primatas.

DESENVOLVIMENTO DE INFECÇÕES MISTAS DE T. cruzi EM TRIATOMÍNEOS

SCLE10 CL Brener Col1.7G2 JG PNM Mistura 239 275 255 259 273 275 271 281 Mistura

Infecções experimentais em triatomíneos Dipetalogaster maximus Ninfas de 3° estágio

Obtenção de tripomastigotas sangüíneas CL JG PNM Obtenção de tripomastigotas sangüíneas JG PNM CL 200 parasitas/ml 67parasitas/ml de cada Alimentação de triatomíneos CL + JG + PNM JG PNM CL

Alimentação artificial dos triatomíneos A  parafilme B  recipiente para o sangue C  sangue D  câmara aquecida (37°C) E  conector do banho maria circulante

Coleta do contéudo intestinal dos triatomíneos Tempo de infecção 30 e 60 dias Extração de DNA total Proteinase K Guanidina 6M Lise Alcalina Fervura

Padronização da metodologia D. maximus infectados com CL Brener (60 dias de infecção) SCLE10

Infecções mistas de T. cruzi em triatomíneos de diferentes ecótopos Triatoma infestans (doméstico) Rhodnius neglectus (silvestre) X

Infecções em T. infestans CL Brener Col1.7G2 JG PNM Infecções isoladas 200 parasitas/ml CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por pop. 30 dias CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por pop. 60 dias Infecções mistas CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 200 parasitas/ml por pop. 60 dias

Infecções isoladas em T. infestans - SCLE10 Col1.7G2 JG CL Brener Col1.7G2 PNM JG CL Brener Col1.7G2 PNM JG JG PNM

Infecções isoladas em T. infestans - SCLE10 CL Brener PNM CL Brener Col1.7G2 PNM JG CL Brener Col1.7G2 PNM JG CL PNM

Infecções isoladas em T. infestans 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 CL Brener Infecções realizadas % de fezes positivas Col1.7G2 PNM JG Infecções isoladas em T. infestans SCLE10 200 parasitas/ml 60 dias

T. Infestans infectados CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG Infecções mistas em T. infestans C + CL Brener Col1.7G2 PNM JG CL PNM C - T. Infestans infectados CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml 60 dias SCLE10 C +

Infecções mistas em T. infestans 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Populações de T. cruzi detectadas % de fezes positivas CLBrener Col1.7G2 PNM JG Infecções mistas em infestans (CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG) Protocolos de infecção 50 parasitas/ml por pop. 30 dias 50 parasitas/ml por pop. 60 dias 200 parasitas/ml por pop. 60 dias SCLE10

Protocolos de infecções CLBrener+Col1.7G2+PNM+JG Ausência do clone CL Brener na infecção mista 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Populações de T. cruzi detectadas % de fezes positivas Infecções mistas em infestans CL Brener Col1.7G2 PNM JG Protocolos de infecções CLBrener+Col1.7G2+PNM+JG Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por população 60 dias

Infecções isoladas em R. neglectus 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 realizadas % de fezes positivas CL Brener Col1.7G2 PNM JG 200 parasitas/ml 60 dias SCLE10

Infecções mistas em R. neglectus CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG (50 parasitas/ml por população) R. neglectus Infecção mista 60 dias C + CL Brener Col1.7G2 PNM JG JG PNM SCLE10

CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG (50 parasitas/ml por população) Infecções mistas em R. neglectus CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG (50 parasitas/ml por população) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CL Brener Col1.7G2 PNM JG Populações de T. cruzi detectadas % de insetos infectados Tempo de infecção 30 dias 60 dias SCLE10

CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG (50 parasitas/ml por população) Reduções populacionais em T. infestans e em R. neglectus CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG (50 parasitas/ml por população) infecções 100 100 90 90 80 80 T. infestans 30 dias 70 70 60 60 % de fezes infectadas % de fezes infectadas T. infestans 60 dias 50 50 40 40 30 30 R. neglectus 30 dias 20 20 10 10 R. neglectus 60 dias 1 1 2 2 3 3 4 4 número de populações de número de populações de T. T. cruzi cruzi detectadas detectadas

Conclusões Padronizamos uma metodologia capaz de identificar e caracterizar populações de T. cruzi presentes em infecções mistas diretamente nas fezes de triatomíneos infectados, utilizando microssatélites de DNA. As populações de T. cruzi: CL Brener, Col1.7G2, PNM e JG são capazes de estabelecerem consideráveis níveis de infecções quando infectadas isoladamente em ambas espécies de triatomíneos: T. infestans e R. neglectus. Detectamos uma seleção positiva para o clone CL Brener, em detrimento do desaparecimento gradativo das demais populações de T. cruzi em T. infestans submetidos às infecções mistas.

Conclusões Não encontramos seleção para nenhuma das populações de T. cruzi presentes nas infecções mistas em R. neglectus, visto que todas as populações do parasita foram encontradas em proporções semelhantes nas fezes dos triatomíneos infectados. O nível de redução populacional das infecções mistas em T. infestans foi maior do que o encontrado nos R. neglectus. Todos estes resultados indicam um comportamento diferencial de infecções mistas de T. cruzi em diferentes espécies de triatomíneos.

Agradecimentos À profa. Andréa Mara Macedo Ao prof. Sérgio Pena Aos professores Egler Chiari e Lúcia Galvão À profa. Mirian Martins Aos professores: Octávio Fernandes, Liléia Diotaiuti e Bianca Zingales A todos os amigos do Laboratório de Genética Bioquímica À Neuzinha, Katita, Miroca e Afonso. Aos meus pais.