Giovana Giacomini

Introdução Trypanosoma cruzi Doença de Chagas 10 milhões Fase aguda Fase indeterminada Fase crônica Doença de Chagas 10 milhões

Introdução Trypanosoma cruzi Grande diversidade genética classificação RAPD (random amplified polymorphic DNA) MLEE (multilocus enzyme eletrophoresis) DTU (discrete typing unit) conjuntos de unidades populacionais geneticamente mais relacionadas entre si do que qualquer com outra população 6 DTUs Emergência de DTUs: recombinação IIa e IIc = I + IIb IId e IIe = IIb + IIc TCI TCII IIa, IIb, IIc, IId e IIe

Introdução Identificação dos DTUs é de alta relevância para estudos clínicos e epidemiológicos Exploração de possíveis ligações entre diversidade genética X pleomorfismo na severidade e sintomas Rastreamento molecular de populações silvestres Método discriminatório molecular simples e sensível

Aplicar a análise MLP à 12 loci gênicos Objetivo Aplicar a análise MLP à 12 loci gênicos Genes envolvidos na relação hospedeiro-parasita devido a possível propensão à polimorfismos como uma resposta adaptativa à pressão seletiva imune Comparação com resultados obtidos por RAPD (validação taxonômica) e MLEE (aplicações práticas) Prova de evidência para aplicabilidade

Materiais e Métodos 20 cepas de T. cruzi Amostras de sangue: 10 humanas e 21 outros mamíferos Amostras do conteúdo intestinal: 19 Mepraia spinolai

Materiais e Métodos PCR 12 genes GenBank: sequências correspondentes Primer Premier PCR

Materiais e Métodos PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment-Length Polymorfism) Avaliar a diferença nas sequências de DNA Microchip (eletroforese capilar) Produto da PCR Clivagem por enzimas de restrição (Webcutter) Separação dos fragmentos Eletroforese em gel de agarose

Materiais e Métodos 1ª etapa: 6 cepas T. cruzi e T. cruzi marinkellei (“7-strain analysis”) Análise final: 1 enzima por marcador

Resultados 1ª etapa: 7-strain analysis 2ª etapa: 20 cepas gp72 (TaqI) genótipos heterozigotos 1f8 (Alw21I) Sobreposição dos padrões dos supostos ancestrais

Resultados Polimorfismos entre DTUs Fragmentos únicos DTUs específicos Combinações de características únicas

Resultados Polimorfismos intra-DTUs gp63 (TaiI)

Resultados Aplicação do PCR-RFLP em amostras de hospedeiros 1f8/Alw21I IIa IIc IIa IIc + I IIb IId IIe + I IIb IId IIe + IIb IId IIe + I

Conclusões Concordância dos resultados encontrados com PCR-RFLP com a classificação baseada na MLEE e RAPD. Algoritmo para identificação de DTUs T. cruzi. - Análise MLP representou uma nova alternativa aos métodos moleculares existente. - Simples, discriminação em vários níveis, aplicado diretamente para amostras dos hospedeiros. - Ferramenta importante para estudos epidemiológicos e ações de controle.

Segunda Reunião Satélite – XXXVI Reunião Anual em Pesquisa Básica sobre a Doença de Chagas (Búzio, RJ – 2009) Fonte: Zingales et al., 2009

OBRIGADA!!!