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Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Detecção de ANA por imunofluorescência.

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Apresentação em tema: "Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Detecção de ANA por imunofluorescência."— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Detecção de ANA por imunofluorescência

2 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Doenças Autoimunes Ehrlich – horror autotoxicus Ehrlich – horror autotoxicus Owens (1945) – Apesar da partilha sanguinea os gémeos bi-vitelinos não se rejeitam: tolerância imunológica ao gémeo Owens (1945) – Apesar da partilha sanguinea os gémeos bi-vitelinos não se rejeitam: tolerância imunológica ao gémeo Billingham (1953) Billingham (1953) transplantes em ratinhos adultos de estirpes diferentes são rejeitados transplantes em ratinhos adultos de estirpes diferentes são rejeitados transplantes em ratinhos neonatais de estirpes diferentes são aceites mesmo depois de atingirem a vida adulta transplantes em ratinhos neonatais de estirpes diferentes são aceites mesmo depois de atingirem a vida adulta Burnet (1956) Teoria da selecção clonal ou dos clones proibidos Burnet (1956) Teoria da selecção clonal ou dos clones proibidos

3 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Mecanismos de tolerância Imunológica Eliminação clonal Eliminação clonal Anergia Clonal Anergia Clonal Supressão da resposta imunitária (células T supressoras) Supressão da resposta imunitária (células T supressoras) Falha na apresentação antigénica Falha na apresentação antigénica Baixa expressão de HLA-II Baixa expressão de HLA-II Tecidos imunológicamente privilegiados Tecidos imunológicamente privilegiados SNC (barreira hemato-encefálica) SNC (barreira hemato-encefálica) Testiculo (baixa temperatura) Testiculo (baixa temperatura) câmara anterior do olho (elevada [TGF ]) câmara anterior do olho (elevada [TGF ]) Rede idiotipo-antiidiotipo Rede idiotipo-antiidiotipo

4 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Mecanismos de Indução de auto-imunidade (I) Falha de eliminação clonal Falha de eliminação clonal Linfócitos B1(CD5+) Linfócitos B1(CD5+) Alterações na apresentação antigénica Alterações na apresentação antigénica Modificações dos autoantigénios Modificações dos autoantigénios Mimetismo molecular Mimetismo molecular Expressão ectópica de HLA-II Expressão ectópica de HLA-II Rotura de anergia clonal Rotura de anergia clonal IL-2 IL-2 Expressão defeituosa de faz Expressão defeituosa de faz Activação policlonal Activação policlonal LPS LPS Superantigénios Superantigénios Rotura de anergia clonal Rotura de anergia clonal Falha da regulação da resposta imunológica Falha da regulação da resposta imunológica Falha das células supressoras mantém uma resposta em actividade Falha das células supressoras mantém uma resposta em actividade Regulação antiidiotipica Regulação antiidiotipica reacção cruzada com anticorpo anti bacterianoreacção cruzada com anticorpo anti bacteriano Anticorpos mimetizando ligandos celulares, induzem respostas via receptores celularesAnticorpos mimetizando ligandos celulares, induzem respostas via receptores celulares Equilibrio Th1/Th2 Equilibrio Th1/Th2 Regulação neuro-hormonal da resposta imunológica Regulação neuro-hormonal da resposta imunológica

5 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Patologias autoimunes sistémicas e de órgão LES LES Lúpus discóide Lúpus discóide Esclerodermia Esclerodermia Citopenias autoimunes Citopenias autoimunes Síndrome de Goodpasture Síndrome de Goodpasture Cirrose Biliar Primária Cirrose Biliar Primária Hepatite crónica activa Hepatite crónica activa Síndrome Guillain-Barré Síndrome Guillain-Barré Uveite Uveite Fibrose Pulmonar Idiopát. Fibrose Pulmonar Idiopát. Artrite reumatóide Artrite reumatóide Artrite reumatóide juvenil Artrite reumatóide juvenil Sindrome de Sjögren Sindrome de Sjögren DMID (Diabetes ) DMID (Diabetes ) Psoriase Psoriase Doença de Graves Doença de Graves Doença de Hashimoto Doença de Hashimoto Esclerose Múltipla Esclerose Múltipla Colite ulcerosa Colite ulcerosa Doença de Chron Doença de Chron Miastenia Gravis Miastenia Gravis

6 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Rheumatoid Arthritis An autoimmune disorder affecting connective tissue. An autoimmune disorder affecting connective tissue. 3 million afflicted in US 3 million afflicted in US Afflicts women during menopause Afflicts women during menopause years of age years of age shorten life expectancy by 3-7 years shorten life expectancy by 3-7 years Afflicts men = women after 65 years of age Afflicts men = women after 65 years of age shorten life expectancy by 7-10 years for men. shorten life expectancy by 7-10 years for men. Etiology Etiology Combination of factors including a genetic predisposition and triggered by unknown infectious agent (possibly EBV). Combination of factors including a genetic predisposition and triggered by unknown infectious agent (possibly EBV).

7 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Clinical Manifestations Joint problems over time Joint problems over time Occur symmetrically Occur symmetrically Alteration in the wrist Alteration in the wrist Ulnar drift Ulnar drift Boutonniere deformity Boutonniere deformity Swan-neck deformity Swan-neck deformity Rheumatoid nodules Rheumatoid nodules

8 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda EXAMPLE OF ARTHRITIS OF THE LEFT KNEE

9 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Systemic Lupus Erythmatosus Chronic, inflammatory, autoimmune disorder Chronic, inflammatory, autoimmune disorder 2 types: discoid and systemic 2 types: discoid and systemic Etiology - unclear Etiology - unclear May be several risk factors - infection, exposure to UVB, environmental irritants May be several risk factors - infection, exposure to UVB, environmental irritants

10 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Systemic Lupus Erythmatosus Pathophysiology Pathophysiology Produce autoantibodies due to defect in T- suppressor cells; NK cells are also suppressed Produce autoantibodies due to defect in T- suppressor cells; NK cells are also suppressed Autoantibodies - antinuclear antibodies (ANA) Autoantibodies - antinuclear antibodies (ANA) when cell dies, nuclei bind with ANA, forms immune complex that stimulates inflammatory response when cell dies, nuclei bind with ANA, forms immune complex that stimulates inflammatory response Immune complex also stimulates activation of complement Immune complex also stimulates activation of complement

11 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Discoid Lupus

12 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Lupus

13 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

14 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Discoid Lesions: a thick, disk-like rash that scars, usually on sun- exposed areas Malar Rash (Butterfly Rash) Arthritis: inflammation of peripheral joints with tenderness, swelling or effusion with skin changes

15 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Oral Ulcers Pericarditis

16 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Diagnóstico de D. Autoimune (I) Provas directas Reprodução num recipiente normal por transferência de anticorpos Reprodução num recipiente normal por transferência de anticorpos Não aplicável ao Homem Não aplicável ao Homem Provas indirectas Reprodução em animais Reprodução em animais por imunização com auto- antigénios por imunização com auto- antigénios Requer conhecimento do auto-antigénio Requer conhecimento do auto-antigénio Requer a administração de potentes adjuvantes Requer a administração de potentes adjuvantes Por transferência de Linfócitos para ratinhos SCID Por transferência de Linfócitos para ratinhos SCID Identificação de auto-anticorpos ou células T auto-reactivas nos órgãos alvo Identificação de auto-anticorpos ou células T auto-reactivas nos órgãos alvo

17 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Diagnóstico de D. Autoimune (II) Provas circunstanciais Associação com outras doenças auto-imunes Associação com outras doenças auto-imunes Infiltração linfocitica nos órgãos afectados Infiltração linfocitica nos órgãos afectados Associação com determinados haplotipos HLA Associação com determinados haplotipos HLA Detecção sérica de autoanticorpos Detecção sérica de autoanticorpos Resposta favorável a imuno-supressores Resposta favorável a imuno-supressores

18 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda

19 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Suggested Clinical and Laboratory Criteria For The Diagnosis of Antiphospholipid Syndrome

20 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda How is Lupus diagnosed? When a doctor thinks a patient may have Lupus, an ANA blood test is ordered. When a doctor thinks a patient may have Lupus, an ANA blood test is ordered. Other tests such as an anti-dsDNA, anti-Sm, anti-Ro/SS-A, and anti-RNP also may be ordered to determine if a patient has Lupus. Other tests such as an anti-dsDNA, anti-Sm, anti-Ro/SS-A, and anti-RNP also may be ordered to determine if a patient has Lupus. Complement tests are performed to measure the amount of complement proteins circulating in the blood. Complement tests are performed to measure the amount of complement proteins circulating in the blood.

21 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Diagnostic Studies ANAs are the best screening test ANAs are the best screening test Antibodies to double-stranded DNA (dsDNA) and to Sm are relatively specific for SLE Antibodies to double-stranded DNA (dsDNA) and to Sm are relatively specific for SLE Determining the complete autoantibody profile of each patient helps predict clinical subsets. High serum levels of ANAs and anti-dsDNA and low levels of complement usually reflect disease activity, especially in patients with nephritis Determining the complete autoantibody profile of each patient helps predict clinical subsets. High serum levels of ANAs and anti-dsDNA and low levels of complement usually reflect disease activity, especially in patients with nephritis

22 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Algorithm for the diagnosis of SLE. ANA, antinuclear antibody; ACR, American College of Rheumatology; CTD, connective tissue disease; WBC, white blood cell count; RBC, red blood cell count, *, recommended in initial evaluation.

23 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Diagnóstico de D. Autoimune (II) Provas circunstanciais Associação com outras doenças auto-imunes Associação com outras doenças auto-imunes Infiltração linfocitica nos órgãos afectados Infiltração linfocitica nos órgãos afectados Associação com determinados haplotipos HLA Associação com determinados haplotipos HLA Detecção sérica de autoanticorpos Detecção sérica de autoanticorpos Resposta favorável a imuno-supressores Resposta favorável a imuno-supressores

24 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Doenças associadas a ANA

25 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Auto-antigénios detectáveis com as células Hep-2

26 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2 (II) Soro colhido fresco ou a 4ºC (1-2 semanas) ou a –20ºC (periodos + longos) Soro colhido fresco ou a 4ºC (1-2 semanas) ou a –20ºC (periodos + longos) Evitar ciclos congelar/descongelar Evitar ciclos congelar/descongelar Congelação pode concentrar o soro (liofilização) Congelação pode concentrar o soro (liofilização) Testar diluições seriadas do soro em PBS (1:40, 1:80, 1:160,...) (semi-quantificação do título, melhores padrões, evitar falsos positivos ) Testar diluições seriadas do soro em PBS (1:40, 1:80, 1:160,...) (semi-quantificação do título, melhores padrões, evitar falsos positivos )

27 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2 (II) Láminas com as células Hep-2 em monocamada (vários poços/lâmina). Deixar as lâminas chegar a RT antes de abrir o pacote selado. Láminas com as células Hep-2 em monocamada (vários poços/lâmina). Deixar as lâminas chegar a RT antes de abrir o pacote selado. Adicionar o soro diluído a testar, e incubar 30 min em incubadora húmida a RT Adicionar o soro diluído a testar, e incubar 30 min em incubadora húmida a RT Lavar com PBS Lavar com PBS Adicionar o secundário (cabra, ovelha ou coelho) marcado com FITC, e incubar como acima Adicionar o secundário (cabra, ovelha ou coelho) marcado com FITC, e incubar como acima Universal (anti IgH de IgG,IgM,IgA não purificado) Universal (anti IgH de IgG,IgM,IgA não purificado) Anti-IgG (as mais importantes p/ diagnóstico) Anti-IgG (as mais importantes p/ diagnóstico) Anti-IgM (SLE pediátrico) Anti-IgM (SLE pediátrico) Lavar com PBS Lavar com PBS Contrastar com 1 a 2 gotas de Azul de Evans a 1% por 100 mL PBS Contrastar com 1 a 2 gotas de Azul de Evans a 1% por 100 mL PBS Lavar com PBS Lavar com PBS Montar em glicerol Montar em glicerol

28 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Padrões Hep-2 (I)

29 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Padrões Hep-2 (II)

30 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Padrões Hep-2

31 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Padrões gerais ANA (Nucleares)

32 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Tipos de padrões Hep-2

33 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Resolução de Problemas


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