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Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo: Aplicações.

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Apresentação em tema: "Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo: Aplicações."— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo: Aplicações

2 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Identificação Celular por Dispersão FS e SS Granulócitos Linfócitos Monócitos

3 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Imunofenotipagem

4 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda IOTest 3 Combinations List 24 Relevant Tubes 24 Relevant Tubes 2 Controls 2 Controls One tube is for intra-cellular testing One tube is for intra-cellular testing Kappa & Lambda polyclonals from Dako Kappa & Lambda polyclonals from Dako FITC- and PE-conjugations performed at IOT FITC- and PE-conjugations performed at IOT

5 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda IOTest 3 Combinations List + Target Diseases

6 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda IOTest 3 Combinations List + Target Diseases

7 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Quantificação antigénica

8 Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Quantificação de antigénios em Citometria de Fluxo

9 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda BioCytex MARQUIS TECHNIQUE Beads contain calibrated amounts of anti- mouse IgG molecules. Beads contain calibrated amounts of anti- mouse IgG molecules. Size mimics size of target molecule/receptor. Size mimics size of target molecule/receptor. Amount of molecules on beads reflects expression level of target molecule/receptor. Amount of molecules on beads reflects expression level of target molecule/receptor.

10 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure Calibration Beads

11 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure Negative Control

12 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure CD38 Positive Sample

13 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Data Analysis Procedure

14 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Pesquisa de populações raras

15 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Time (Seconds) Stimulation Calcium Flux - Indo-1 Estudos Cinéticos

16 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Análise de Ciclo Celular G2G2G2G2 M G0G0G0G0 G1G1G1G1 S CountCount G0G0G0G0 /G 1 /G 1 S G2G2G2G2/M DNA content 2N 4N

17 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Apoptose

18 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Separação Celular Formação de gotículas Formação de gotículas Tempo Tempo Coincidência - Pureza e Eficiência Coincidência - Pureza e Eficiência 488 nm laser Sensor Fs Detectores de Fluorescências + Placas Carregadas Tubos para Recolha do Produto Separado -

19 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda QC Workflow Alignment Check Basic Elements of Daily QC Fluorescent Standard Color Compensation Process/ Method Control Run PatientObtain ResultsGenerate Report Patient Analysis Troubleshoot Maintenance FAIL PASS Call Service Fix Problem Test Reimbursement

20 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda AUTOMATIZAÇÃO TQ-Prep PrepPlusQ-Prep

21 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda TQ-Prep / ImmunoPrep Reagent Sistema automático de lisis de eritrocitos Sistema automático de lisis de eritrocitos No requiere lavado No requiere lavado Preserva la morfología Preserva la morfología Utiliza carruseles compatibles con XL-MCL, FC500, PrepPlus y CellPrep Utiliza carruseles compatibles con XL-MCL, FC500, PrepPlus y CellPrep TQ-PREP

22 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda PrepPlus – TQ-Prep Sistema automático de carga de muestra y reactivos para citometría de flujo Sistema automático de carga de muestra y reactivos para citometría de flujo Utiliza tubos primarios de cualquier marca Utiliza tubos primarios de cualquier marca Rack de hasta 24 tubos primarios con agitación para homogeneizar la muestra Rack de hasta 24 tubos primarios con agitación para homogeneizar la muestra Controlado por el TQ- Prep Controlado por el TQ- Prep

23 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda PrepPlus – TQ-Prep Posibilidad de carga desde tubo abierto Posibilidad de carga desde tubo abierto 3 soportes diferentes para reactivos 3 soportes diferentes para reactivos Puede cargar anticuepos monoclonales, FlowCount y reactivos de control de calidad Puede cargar anticuepos monoclonales, FlowCount y reactivos de control de calidad

24 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda CellPrep Sistema de lavado celular por fibra hueca Sistema de lavado celular por fibra hueca Sustituye a la centrifugación Sustituye a la centrifugación Mantiene la viabilidad celular Mantiene la viabilidad celular Mantiene la morfología y preserva células lábiles Mantiene la morfología y preserva células lábiles No activa ni destruye plaquetas No activa ni destruye plaquetas Utiliza sangre entera, sangre lisada y cualquier suspensión celular Utiliza sangre entera, sangre lisada y cualquier suspensión celular

25 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda CellPrep Fibras huecas con poros de 0.65 µm, que permiten la salida de mol é culas y l í quido de la suspensi ó n original Fibras huecas con poros de 0.65 µm, que permiten la salida de mol é culas y l í quido de la suspensi ó n original Permite la concentraci ó n final de la muestra Permite la concentraci ó n final de la muestra Diferentes programas pregrabados, as í como posibilidad de crear programas propios Diferentes programas pregrabados, as í como posibilidad de crear programas propios

26 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Citometria de Imagem: Uma nova Tecnologia no apoio à Anatomia Patológica

27 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Tipos de amostras possiveis de analisar por Citometria de Imagem: Etanol Glutaraldeido Tecido fixado Tecido a fresco Tecido criopreservado Tecido sólido Tecido líquido Sem preservação Com preservação Tecido a fresco congelado Paraformaldeido Formaldeido e incluído em parafina Amostra

28 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Parâmetros possíveis de analisar por Citometria de Imagem: Total de partículas Forma Tamanho Área Diâmetro Perímetro Perfeição Irregularidade

29 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Requisitos Básicos num Citómetro de Imagem:

30 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Captação dos Parâmetros de Análise: Núcleo Marcado Branco Preto

31 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Citometria de Imagem:

32 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda Protocolo para Citometria de Imagem: Partindo de um fragmento de tecido sólido, fixado em formol, processado e incluído em parafina. Partindo de um fragmento de tecido sólido, fixado em formol, processado e incluído em parafina. Corte a 8 m, extensão em lâminas de gelatina Corte a 8 m, extensão em lâminas de gelatina Desparafinar Desparafinar Pós fixar com fixador de Bohm Pós fixar com fixador de Bohm Hidratar Hidratar Efectuar uma Hidrólise Ácida Efectuar uma Hidrólise Ácida Marcar as células com reagente de Shiff Marcar as células com reagente de Shiff Lavar com SO2 Lavar com SO2 Desidratar Desidratar Montar Montar Quantificar o conteúdo em ADN e o ciclo celular no Citómetro de Imagem Quantificar o conteúdo em ADN e o ciclo celular no Citómetro de Imagem

33 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda MetaCyte - concept microscope slide is scanned field by field at lowest possible magnification without gaps objects of interest are automatically identified; gallery images, object features and positions are recorded microscope slide is scanned field by field at lowest possible magnification without gaps objects of interest are automatically identified; gallery images, object features and positions are recorded

34 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda MetaCyte - concept on screen review of analyzed cellson screen review of analyzed cells false positives can be rejectedfalse positives can be rejected cells suitable for analysis are preselected with a mouse clickcells suitable for analysis are preselected with a mouse click preselected objects can be automatically relocated at 100x to capture high resolution images for analysispreselected objects can be automatically relocated at 100x to capture high resolution images for analysis on screen review of analyzed cellson screen review of analyzed cells false positives can be rejectedfalse positives can be rejected cells suitable for analysis are preselected with a mouse clickcells suitable for analysis are preselected with a mouse click preselected objects can be automatically relocated at 100x to capture high resolution images for analysispreselected objects can be automatically relocated at 100x to capture high resolution images for analysis

35 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda MetaCyte - concept histogram or scatter plot display of measured featureshistogram or scatter plot display of measured features gating for selection of subpopulationsgating for selection of subpopulations relocation of cells detected in a previous scan after re-stainingrelocation of cells detected in a previous scan after re-staining histogram or scatter plot display of measured featureshistogram or scatter plot display of measured features gating for selection of subpopulationsgating for selection of subpopulations relocation of cells detected in a previous scan after re-stainingrelocation of cells detected in a previous scan after re-staining

36 Técnicas de Imunologia Prof. Doutor José Cabeda MetaCyte - concept Motorized microscope (z) Motorized stage (x,y) CCD Camera MetaCyte PC Win 9x/NT image analysis microscope control


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