Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia

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1 Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia
Investigação de Marcadores Moleculares em Lesões Benignas e Neoplasias do Trato Digestório Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP

2 NEOPLASIAS TRATO DIGESTÓRIO
CÂNCER DE ESÔFAGO: 3º tipo (mundo) 6º tipo Brasil ( casos) ~85% carcinomas CÂNCER GÁSTRICO: 2º tipo (mundo) 3º tipo Brasil ( casos) ~95% adenocarcinomas

3 CARCINOGÊNESE DO ESÔFAGO
ÁLCOOL E FUMO FATORES DE RISCO Ambiental e genéticos História familial Agentes infecciosos (HPV) Megaesôfago chagásico Esôfago de Barrett Lesões cáusticas Aneuploidias Mutação genes supressores: TP53, P16, P17, FHIT Ativação de oncogenes: CCND1, HER-2/neu

4 Doença de Chagas - Fase crônica
Brasil: 50-60% chagásicos na fase crônica sem manifestações clínicas 2-4% fase crônica sintomática Intestino grosso (megacólon) Coração Esôfago (megaesôfago) 80%

5 Complicação tardia mais séria do megaesôfago
Risco de 3-8% Megaesôfago chagásico Carcinoma de células escamosas do esôfago Complicação tardia mais séria do megaesôfago 5% dos pacientes com MC em idade mais jovem em relação àqueles sem a doença Contato prolongado de agentes carcinógenos alimentares com a mucosa  estase alimentar  aumento do crescimento bacteriano e irritação química  esofagite crônica

6 C ARCINOMA DE ESÔFAGO Chagásicos crônicos: com e sem megaesôfago
Esofagites crônicas Megaesôfago chagásico (MC) FISH: aneuploidias 7, 11, 17 deleção TP53 amplificação CCND1 Imuno: Expressão proteínas: p53, p16 e fhit Apoptose: caspase-3 ativada Proliferação celular: antígeno Ki-67 Molecular: Mutações TP53, MTS-1 e FHIT (PCR-SSCP, sequenciamento) T. cruzi: polimorfismos do kDNA (sangue e mucosa) CGH MC: 60% aneuploidias (-7,+7, -17, +17) 54,5% deleção TP53 CE: 100% tri e tetrassomias 100% deleção TP53 70% CCND1

7 CARCINOGÊNESE GÁSTRICA

8 CÂNCER GÁSTRICO Incidência elevada: Japão, China, Costa Rica, Chile e Portugal Brasil: Estimativas para 2006 (INCA) casos novos Homens: 2x mais afetados

9 TIPOS HISTOLÓGICOS DO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO
ADENOCARCINOMA TIPO INTESTINAL OU BEM DIFERENCIADO: Presença de lesões pré-neoplásicas Predominante em homens e idosos ADENOCARCINOMA TIPO DIFUSO OU POUCO DIFERENCIADO: Prognóstico pior Não associado a lesões pré-cancerosas Mais frequente em mulheres e jovens

10 Lesões pré-cancerosas
Helicobacter pylori Gastrectomia Anterior Predisposição Genética Tabaco Lesões do DNA Álcool Alimentos salgados , enlatados e defumados CARCINOGÊNESE GÁSTRICA

11 Colonização da mucosa gástrica pela Helicobacter pylori (modificado Yoshiyama e Nakazawa, 2000)
Prevalência da Hp: 40 a 50% na população  9 vezes risco de câncer gástrico Geração de radicais livres (espécies de oxigênio e nitrogênio reativos) → danos no DNA Alterações na secreção de fatores de crescimento e citocinas Desregulação do ciclo celular do epitélio gástrico → proliferação celular ↑ x apoptose ↑

12 (renovação celular normal) (­ da proliferação celular)
Estômago Normal Gastrite H.pylori Úlcera Gastrite atrófica Apoptose regulada Apoptose ­ Apoptose ­­ + Inflamação TNF  CD95 NO + Inflamação TNF  CD95 NO Proliferação regulada Proliferação ­ Proliferação ¯ Homeostase (renovação celular normal) Homeostase (­ da proliferação celular) Desequilíbrio (perda de células) HOMEOSTASE E DESEQUILÍBRIO DA MUCOSA GÁSTRICA (modificado Wagner et al., 1997)

13 CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO
Alterações genéticas e epigenéticas Oncogenes Genes supressores de tumor Reguladores do ciclo celular Moléculas de adesão celular (caderinas) Genes de reparo do DNA Instabilidade genética Ativação de telomerases

14 PERDAS E GANHOS CROMOSSÔMICOS
Cromossomos Regiões Cromossômicas Genes 1 1p (1p36) ; 1q22-q31 p73 2 2pter-p23; 2q; 2q 3 3p14; 3q (3q12-qter) FHIT 4 4q32 5 5q21 APC 7 7pq; 7q22; 7q31 ERBB; EGFR, HGF; c-MET 8 8pq; 8q (8q23-24) c-MYC 9 9p (9p21) CDKN2A (p21) 12 12q (12q24) EPS8; DOC-1 13 13q (13q21-22) receptor de serotonina 14 14q (14q24) 15 15q (15q11-q15) 16 16pq, 16q22 E-Caderina 17 17p (17p13); 17q; 17q (17q12-q21) TP53, c-ERBB2, gastrina 18 18q21; 18q DCC 19 19p(19p13); 19q(19q13) 20 20pq; 20q11-q12 22 22q

15 CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO (modificado Tahara, 2004)
INTESTINAL C-ERBB2 C-MET CICLINA E TP53 APC TP53 p27 D1S191 HIPERMETLAÇÃO MUCOSA NORMAL METAPLASIA INTESTINAL ADENOMA CÂNCER INICIAL DIFERENCIADO CÂNCER AVANÇADO INVASÃO METÁSTASES LOH 1p36 (p73) LOH 7q  p27  TELOMERASE hTERT H. pylori  TELÔMEROS INSTABILIDADE GENÉTICA CD44 ALTERADO  CICLINA E CD44 ALTERADO CÂNCER INICIAL DIFERENCIADO CÂNCER AVANÇADO INVASÃO METÁSTASES MUCOSA NORMAL LOH 17q21 MUTAÇÃO/PERDA E CADERINA AMPLIFICAÇÃO K-SAM c-MET DIFUSO MUTAÇÃO/LOH TP53

16 Escasses de estudos genéticos em lesões gástricas precursoras com potencial pré-neoplásico  indicar marcadores cromossômicos associados com a carcinogênese gástrica FISH -aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17) -deleções no gene TP53, -amplificação CCND1 e Her-2/neu (c-erbb-2) lesões gástricas benignas e adenocarcinoma gástrico MOLECULAR Avaliação da H. pylori Polimorfismos: CYP, GST, XRCC1, XRCC3, COX2, NOS2 Expressão gênica: PCR Real Time RaSH (hibridação subtrativa rápida) Metilação IMUNO-HISTOQUÍMICA expressão das proteínas: -p53 -ciclina D1 e p185 (Her-2/neu) Comparar os resultados obtidos em lesões benignas com aqueles de adenocarcinomas gástricos  ressaltar alterações genéticas que possam estar relacionadas com a progressão das lesões benignas, e maior risco de malignização  utilizadas no diagnóstico precoce e prognóstico

17 MATERIAL Controle: 10 biópsias mucosas gástricas histologicamente normais e H. pylori negativas Lesões gástricas: 113 (biópsias/frag. cirúrgico) 38 gastrites crônicas 13 gastrites atróficas crônicas 21 úlceras gástricas 21 metaplasias intestinais 20 adenocarcinomas gástricos

18 Gastrite crônica e gastrite atrófica  associada com H
Gastrite crônica e gastrite atrófica  associada com H. pylori  precede a formação do câncer gástrico Úlcera péptica  maior risco de câncer gástrico Objetivos: avaliar a ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17); deleção e expressão do gene TP53. Amostras: 38 gastrite crônica 13 gastrite atrófica 21 úlcera gástrica

19 Aneuploidias: frequência crescente de GC (21%) para GAC (31%) e para UG (62%)
Gastrite crônica: 8/38 casos  -7, +7  75% Hp+ Gastrite atrófica crônica: 4/13 casos  +7, +8  100% Hp+ Deleção TP53: não observada Expressão aumentada da p53: Gastrite crônica: 5/11 (45%)

20 Úlcera gástrica: 13/21 casos (62%)  +7,+8; +17  69% Hp+
Expressão aumentada da p53: 2/17 (12%)

21 GC: +7 GC: -7 UG: +8 ↑p53 em GC e UG: super expressão da proteína selvagem → resposta fisiológica ao processo inflamatório do epitélio gástrico (H. pylori)

22 Metaplasia intestinal: (substituição do epitélio gástrico por células colunares intestinal)
Alguns estudos: mutação do TP53 e superexpressão da proteína p53 em metaplasia adjacente ao tumor. Objetivo: Investigar ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17), deleção e expressão do gene TP53, em metaplasia intestinal de pacientes sem câncer gástrico.

23 71% (15/21) casos MI: aneuploidias +7, +8, +9
Associação: aneuploidias x H. pylori 60% (3/5) casos: deleção TP53 12% (2/17) casos: expressão  p53

24 100% casos: aneuploidias (tri/tetra)
30% (6/20 ): trissomias múltiplas 3/3 casos: deleção TP53 80% (12/15): expressão  p53

25 Metaplasia: +7 Adenocarcinoma +9; +17 Mucosa normal: TP53 (vermelho)
Deleção TP53 1 sinal vermelho Mucosa normal: TP53 (vermelho) 17 (verde)

26 AUMENTO PROGRESSIVO NA FREQÜÊNCIA E COMPLEXIDADE DE CASOS COM ANEUPLOIDIAS
monossomias trissomias

27 IMUNO-HISTOQUÍMICA – p53
Metaplasia p53+ (fraca) Mucosa normal p53- Adenocarcinoma p53+ (forte)

28 Cromossomos 7, 8, 9 e 17  carregam genes importantes que atuam no controle da proliferação celular
7q31: MET 8q24: MYC 9p21: CDKN2A 17p13: TP53 17q21: ERBB-2 (HER-2/NEU) Primeira evidência de alterações numéricas em MI de pacientes sem câncer gástrico  alterações presentes em frequências  adenocarcinoma  conecção cronológica entre essas lesões  expansão monoclonal Ocorrência de instabilidade cromossômica em lesões benignas (GC e UG) que podem ter função importante na carcinogênese do estômago Dosagem anormal e expressão gênica  vantagem proliferativa

29 APOPTOSIS IN DIFFERENT GASTRIC LESIONS AND ASSOCIATION WITH H
APOPTOSIS IN DIFFERENT GASTRIC LESIONS AND ASSOCIATION WITH H. pylori AND EXPRESSIONS OF p53 Apoptose: homeostase do tecido  equilíbrio entre proliferação e morte celular programada Desequilibrio: taxa proliferativa excessiva  potencializa o efeito de carcinógenos  risco de câncer Associação: H. pylori x Apoptose  lesões gástricas ??? H. pylori: risco de 2,7 a 12 vezes de câncer gástrico

30 OBJETIVO: avaliar os IA em diferentes lesões gástricas e comparar com adenocarcinoma gástrico  técnicas que detectam apoptose em fases diferentes: Caspase-3 ativada (CPP32)  mais precoce TUNEL  fragmentação do DNA Associar com H. pylori, aneuploidias e expressão da p53 AM0STRAS: mucosa normal Hp- 34 gastrite crônica 11 gastrite atrófica 17 úlcera gástrica 12 adenocarcinomas

31 IA aumentados: TUNEL: GAC CPP32: GC Adenocarcinomas: IA baixos, sem diferença entre intestinal e difuso

32 G-H: adenocarcinoma gástrico
Table 2 – Aneuploidy, TP53 gene deletion and expression, and clinicopathological data in chronic gastritis (CG), atrophic gastritis (CAG) and gastric ulcer (GU) cases. TUNEL CPP32 A B C D E F G H A-B:gastrite crônica C-D: úlcera gástrica E-F: metaplasia intestinal G-H: adenocarcinoma gástrico

33 CONCLUSÕES Não houve associação entre apoptose aumentada e infecção pela H. pylori, aneuploidias e super expressão da proteína p53 não houve correlação entre os IA encontrados por ambas as técnicas, aumento de apoptose em GC e GAC, não relacionado com infecção pela H. pylori  reforçando a participação de lesões gástricas com potencial pré-canceroso na tumorigênese do estômago  enfatiza a importância do emprego de métodos diferentes para detecção de apoptose.

34 Regiões homogeneamente coradas (HSR)
Double minutes (DM) aumento do número de cópias: dezenas a centenas de vezes (erros de replicação) Aumento da expressão gênica→proteína Regiões homogeneamente coradas (HSR)

35 Carcinogênese: Genes Amplificados
-CCND1 -c-MET -c-MYC -c-ERBB-2 (HER-2/NEU)

36 -40 adenocarcinoma gástrico -14 mucosa normal
-40 carcinoma esôfago -12 mucosa normal -40 adenocarcinoma gástrico -14 mucosa normal Avaliar a relação entre amplificação e polissomia de CCND1 e Her-2/neu com expressão aumentada das proteínas e aspectos clinicopatológicos→prognóstico FISH Cyclin D1 (vermelho) Her-2 (vermelho) Centrômeros (verde) IMUNO Anticorpos: ciclina D1(nuclear) Her-2 (membrana)

37 AMPLIFICAÇÃO: IMUNO: CCND1: carcinoma esôfago 45% (18/40)
câncer gástrico 10% (4/40) HER-2/NEU: carcinoma esôfago 7,5% (3/40) câncer gástrico 5% (2/40) IMUNO: Cyclin D1+: câncer esôfago 37,5% (15/40) câncer gástrico 35% (14/40) Her-2/neu+: câncer esôfago 12,5% (5/40) câncer gástrico 7,5% (3/40)

38 FISH: (A-B) Amplificação CCND1( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 11 (verde) gene CCND1 (vermelho)

39 FISH: (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

40 IMUNO: (A-B) proteína Cyclin D1+ câncer esôfago e gástrico
(C-D) proteína Her-2+ câncer esôfago e gástrico

41 CONCLUSÕES: -CCND1: mais frequentemente amplificado e proteína super-expressada (ambas neoplasias) → função na progressão de infiltração e metástases → marcador molecular → prognóstico pior e comportamento mais agressivo → invasão, metástases, recorrência e sobrevida reduzida, -Baixa associação entre amplificação x super-expressão → outras vias de expressão alteração na síntese ou estabilidade da proteína alterações na regulação de transcrição gênica

42 EQUIPE COORDENADORA: Profa. Dra Ana Elizabete Silva – UNESP
COLABORADORES: Profa. Dra. Marileila Varella-Garcia – Cancer Center-USA Prof. Dr. Aldenis Albaneze Borim – FAMERP Profa. Dra. Patrícia Maluf Cury – FAMERP Dr. Alaor Caetano – FAMERP Profa. Dra. Kátia Ramos Lopes – Hospital Sírio Libânes - SP PÓS-GRADUANDOS: Ana Cristina Gobbo César Lucimari Bizari Fernanda da Silva Manoel Caetano Marilanda Ferreira Bellini Márcia Cristina Duarte Juliana Garcia de Oliveira Aline Cristina Targa Aparecida Perpétuo Fedossi Héctor Matiolli INICIAÇÃO CIENTÍFICA: Isabella Katz Migliori Yvana Cristina Jorge Auxílio e Bolsa: FAPESP, CAPES e CNPq