Purificação e detecção de Antígenos

Apresentação em tema: "Purificação e detecção de Antígenos"— Transcrição da apresentação:

1 Purificação e detecção de Antígenos
Imunocromatografia Cromatografia de afinidade Eletroforese SDS page Western blotting Imunohistoquímica

2 Cromatografia Método físico-químico de separação, fundamentado na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Cromatografia planar: cromatografia em papel, cromatografia por centrifugação e à cromatografia em camada delgada Cromatografia em coluna, de acordo com fase móvel: líquida, gasosa.

3 Imunocromatografia O método, conhecido como imunocromatografia, ou teste de migração lateral, vale-se de uma membrana de nitrocelulose no formato de fita. Impregnada em cada trecho com Antígenos ou Anticorpos específicos e marcados (ex: ouro coloidal), ela reage com a amostra, indicando ou não a existência dos Acs (ex: Ac anti HIV) ou dos Ags (ex: hormônio betaHCG) pesquisados. A leitura do resultado é feita a olho nu e independe de especialistas.

4 Cromatografia de Afinidade
Cromatografia de afinidade (coluna e líquida) Separa proteínas por suas especificidades de ligação mistura de proteínas é adicionada à coluna contendo polímeros com ligantes específicos para proteína de interesse deixa coluna com a solução de ligantes

5 Eletroforese Método utilizado para separar e purificar macromoléculas (proteínas, RNA, DNA) de diferentes tamanhos, carga ou conformação. Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato) Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel. O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar.

6 GEL para Eletroforese Compostos de agarose ou poliacrilamida
Agarose: polissacarídeo extraído de alga marinha. Usada em concentrações de 0,5 a 2%. Fácil de preparar. Não-tóxico. Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação mas baixa resolução. Muito utilizado para ácidos nucleicos.

7 GEL para eletroforese Poliacrilamida: polímero de ligação cruzada de acrilamida. Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3,5 a 20%). Mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro. Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas alta capacidade de resolução. Muito utilizado para separação de proteínas

8

9 Coloração Gel Coloração com Blue Coomassie que se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas.

10 Eletroforese – SDS page
proteínas migram de acordo com tamanho e forma • a proteina é denaturada, as subunidades se separam cátodo ânodo SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

11 Eletroforese de proteínas

12 Western blotting Gel blotting: técnica de visualização/separação de macromoléculas (DNA,RNA, Proteínas) em uma mistura complexa. protein blotting ou westernblotting ou imunoblotting É um método analítico que envolve a imobilização das proteínas em membranas para posterior detecção/identificação utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais   A proteína previamente separada e denaturada na Eletroforese (SDS page), técnica que fornece informações sobre o peso molecular e a possível existência de isoformas da proteína em estudo, é então imobilizada em membranas como a de nitrocelulose e reconhecida pelos anticorpos marcados

13 Western blotting Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida
Separação e caracterização de proteínas Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação Transferência para membrana por força elétrica Proteína alvo é identificada por Ac mono ou policlonal Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo Informa o tamanho e a quantidade das proteínas

14 Western blotting

15

16 Imunohistoquímica O príncípio básico: reconhecimento do Ag (presente no tecido analisado) por um anticorpo específico, associado a diversos tipos de processos de visualização/revelação.  Cada Ac reconhece apenas um único Ag, que pode ser, uma proteína de uma célula normal ou neoplásica ou de um microrganismo. A técnica usual utiliza um Ac secundário, que se liga ao Ac primário e é associado a um complexo de visualização (complexo avidina-biotina-enzima-cromógeno ou polímero com amplificação). Atualmente há disponibilidade de grande número de Ac primários para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina, permitindo o exame imuno-histoquímico de biópsias, peças cirúrgicas e de necropsias arquivados. Preparados citopatológicos também podem ser utilizados nos exames imuno-citoquímicos.  

17 Imunohistoquímica

18 Imunofluorescencia Trata-se de uma reação imunológica revelada com um marcador fluorescente A primeira técnica utilizada foi a imunofluorescência direta, onde se pesquisou um Ag em uma reação com Ac preparado com o fluorocromo. Para este tipo de reação são utilizados Ac purificados específicos para um determinado Ag conjugados com um fluorocromo. Esta técnica também é chamada de técnica de camada simples.

19 Imunofluorescencia A reação da imunofluorescência indireta, ou técnica de dupla camada, é realizada por Ag fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um Ac específico não fluorescente. E por último coloca-se um Ac fluorescente, contra determinantes antigenicos do primeiro Ac. Esta técnica apresenta como vantagem à possibilidade de se ter uma fluorescência mais evidente, pelo fato do anticorpo fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários. A técnica de imunofluorescência por sanduíche recebe este nome porque o antígeno fica entre dois anticorpos. Esta técnica é aplicada para estudar tecidos linfóides e descobrir que tipo de anticorpos está sendo produzido. (A)              (B)                           (C) Imunofluorescência indireta. O Anticorpo primário marcado com um fluorocromo (A) é excitado a emitir cor (B), que é visualizado na foto de  um lâmina (C).