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Mecanismos de Vascularização Estudo em dois modelos Ana Lúcia Cordeiro António Figueiredo Filipa Godinho Inês Martins Orientadora: Prof. Doutora Delminda.

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1 Mecanismos de Vascularização Estudo em dois modelos Ana Lúcia Cordeiro António Figueiredo Filipa Godinho Inês Martins Orientadora: Prof. Doutora Delminda Magalhães Regente: Prof. Doutora Deolinda Teixeira 23 de Maio, 2005

2 Introdução O que são mecanismos de vascularização? Angiogénese: mecanismo de proliferação de células endoteliais e musculares lisas para formarem novos vasos sanguíneos. Vasculogénese: origina os vasos de grande calibre de novo, no embrião, a partir de percursores mesodermicos conhecidos por angioblastos. Angiogénese propriamente dita: ocorre após formação de grandes troncos vasculares em que estes últimos se ramificam e se distribuem numa rede vascular complexa. Este processo mantém-se durante toda a vida do indivíduo, dependendo de factores de crescimento vascular.

3 VEGF Factor de crescimento vascular endotelial; Regulador chave da angiogénese fisiológica durante a embriogénese, crescimento ósseo, funções reprodutivas; Também está implicado na angiogénese patológica associada a tumores, desordens neovasculares intraoculares... Pertence a uma família que inclui PlGF (Factor de crescimento placentário), VEGF B, C e D; O gene do VEGF A humano está organizado em oito exões separados por sete intrões. O splicing alternativo resulta na formação de quatro isoformas com diferente número de ácidos aminados. Analisou-se o VEGF A porque é o mais bem estudado e o mais importante ao nível do crescimento vascular.

4 Receptor de VEGF (VEGFR) Os efeitos biológicos do VEGF são mediados por dois receptores: VEGFR-1 e VEGFR-2, ambos com acção da cínase da tirosina. Estudou-se o VEGFR-2 porque este é aquele ao qual o VEGF se liga preferencialmente. Estudou-se o tecido cavernoso do pénis de rato devido às patologias que lhe estão associadas, nomeadamente a disfunção eréctil. A glândula supra-renal foi estudada pois é um tecido muito vascularizado. Modelos em estudo

5 Objectivos Identificar as junções intercelulares de aderência. Analisar as alterações na expressão e localização do VEGFR-2 no tecido do corpo cavernoso de pénis de rato. Caracterizar a localização do VEGFR-2 no tecido do corpo cavernoso do pénis de rato. Relacionar o estudo efectuado com patologias. Familiarização com técnicas de microscopia e de laboratório.

6 Métodos Imunocitoquímica 1º dia Desparafinar os cortes; Hidratar em concentrações descendentes de etanol em água; Inibição de peroxídase endógena, usando uma solução de metanol; Aquecer 200 ml de tampão citrato no microondas até a ebulição; Adicionar 100 µl de tampão de incubação; Ligação do anticorpo primário ao corte.

7 2º dia Ligação do anticorpo secundário ao corte; Adicionar cerca de 100 µl de solução de estreptavidina-biotina- peroxidase e incubar durante 30 min; Adicionar solução de DAB/H 2 O 2 ao corte e incubar durante 7 min; Corar com hemateína; Desidratar em etanol de concentrações crescentes e xilol; Montar em Entellan; Observar os cortes ao microscópio de luz.

8 Microscopia electrónica e de luz Preparação dos cortes: Cortes efectuados no ultramicrótomo, usando uma faca de vidro – Cortes semi-finos e ultra-finos; Os cortes semi-finos foram corados com azur, observados ao microscópio óptico e fotografados; Os cortes ultra-finos foram colocados em grelha de cobre e contrastados com acetato de uranilo e citrato de chumbo, sendo posteriormente observados ao microscópio electrónico e fotografados com revelação dos negativos e passagem a papel por método de rotina do laboratório. Preparação de blocos de Epon: Fixação; Pós-fixação com tetróxido de ósmio; Desidratação em etanol com concentrações crescentes; Inclusão em Epon.

9 Resultados Microscopia de luz Imunocitoquímica Fig.1- Amostra controlo de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 20x.

10 Fig.2- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato adulto normal, com ampliação total de 20x.

11 Fig.3- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato idoso (18 meses), com ampliação total de 20x.

12 Fig.4- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato orquidectomizado, com ampliação total de 20x.

13 Coloração com Azur Fig.5- Corte semi-fino de tecido cavernoso de pénis de rato, com ampliação total de 20x.

14 Fig.6- Corte semi-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 40x.

15 Fig.7- Corte semi-fino de tecido de supra-renal de rato, com ampliação total de 20x.

16 Fig.8- Corte semi-fino de tecido de supra-renal de rato, com ampliação total de 40x.

17 Microscopia electrónica Tecido cavernoso de pénis de rato Fig.9- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 4500x.

18 Fig.10- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 9400x.

19 Fig.11- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 4500x.

20 Tecido de supra-renal Fig.12- Corte ultra-fino de tecido de supra-renal de rato com ampliação total de 3400x.

21 Fig.13- Corte ultra-fino de tecido de supra-renal de rato com ampliação total de 5400x.

22 Conclusões Foi possível confirmar a localização de VEGFR-2, o qual se encontra apenas nas células endoteliais, sendo a sua localização e expressão independentes das condições do animal. Aquando da observação ao microscópio electrónico, não se conseguiu identificar junções intercelulares de aderência nas preparações de pénis de rato, contrariamente ao tecido de supra-renal onde estas estruturas eram claramente visíveis. Relativamente às patologias dos tecidos mencionados, não foi possível retirar conclusões neste sentido.

23 Bibliografia Soares T. Angiogénese: mecanismos e factores reguladores. RFML 2003; Série III; 8 (5): Bazzoni G, Deyana E. Endothelial Cell-to-Cell Junctions: Molecular Organization and Role in Vascular Homeostasis. Physiol Rev 84: , Carmeliet P. Mecanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med.2000; 6: Costa C, Soares R, Schmitt F. Angiogenesis: Now and then. APMIS 2004; 112: Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003; 9 (6):

24 Agradecimentos Professora Doutora Delminda Magalhães Professor Doutor Henrique de Almeida Sr. Vitor Hugo Mata Sr. D. Amélia Sarmento Ferreira

25 Obrigado pela atenção!


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