Carregar apresentação
A apresentação está carregando. Por favor, espere
PublicouManuela Moraes Alterado mais de 10 anos atrás
1
Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica
Técnicas de estudo de mutações desconhecidas Prof.Doutor José Cabeda
2
Técnicas de estudo de mutações desconhecidas
Métodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clamps DGGE Perpendicular Paralelo CDGE TTGE Métodos Baseados na conformação SSCP HA CSGE
3
“Melting Profiles” Vários domínios de fusão
As moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total
4
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Gradiente de desnaturação Químico Temperatura O gradiente pode ser: Perpendicular ao campo eléctrico Paralelo ao campo eléctrico
5
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes homoduplexes
6
Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)
7
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão
8
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
Vantagens Mais fácil de fazer os geis Mais reprodutível de gel para gel Desvantagens Mais difícil de acertar a gama de Tm
9
HR-1 0.01ºC/s a 1ºC/s Tambiente a 100ºC High Resolution Melter
24bit Fluorescence 24bit Temperature 5-20µL Volume 40-45 amostras/h (0.3ºC/s) LCGreen I Excitação a nm Emissão a nm High Resolution Melter
10
HR-1
11
Métodos baseados na conformação
Conformação do dsDNA não depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)
12
Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP)
dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido Renaturação rápida Corrida em condições semi-desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) WT1 mutantes WT2
13
Heteroduplex Analysis (HA)
Heterodupletos causam Distorção na conformação Migração no gel mais lenta Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M
14
Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA
15
Conformation Sensitive Gel Electrophoresis
Principio: Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnaturante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com bp
16
DHPLC Coluna Hidrofóbica
Interacção entre coluna e DNA efectuado pelo Acetato de Trietilamónio (TEEA) Libertação da retenção efectuada por um gradiente crescente de Acetonitrilo (ACN) ssDNA menos retido que dsDNA
17
DHPLC BRCA1 Perfil de utilização dos Tampões
18
Transgenomics DHPLC Wave Systems
3500 4000Plus Microbial 3500HT
19
Hibridização desnaturar
20
Hibridização Adicionar sonda
21
Hibridização
22
Hibridização
23
Dot-Blot
24
Variações Hibridização em microplaca hibridização reversa
25
DEIA (hibridização reversa em microplaca) (detecção com anti-dsDNA)
26
Inno-Lippa Hibridização em filtro
Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Hibridização reversa Marcação no produto do PCR
28
Resultados do INNO-LIPA
29
MEIA
30
MEIA
31
Southern Blot
33
Northern Blot Semelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNA
Não utiliza reacções de restrição
34
Hibridização em microchip
Miniaturização de um dot-blot Densidade variável Hibridização automática Leitura automática
35
Hibridização em microchip: procedimento
36
Hibridização em Microchip: Staph-A (1)
37
Hibridização em Microchip: Staph-A (II)
38
Hibridização em Microchip: Coagucheck
Marcadores para factores de risco de trombose
Apresentações semelhantes
© 2024 SlidePlayer.com.br Inc.
All rights reserved.