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Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica Técnicas de estudo de mutações desconhecidas.

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1 Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica Técnicas de estudo de mutações desconhecidas

2 Métodos Baseados No Tm Métodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clamps Melting Profiles and GC clamps DGGE DGGE PerpendicularPerpendicular ParaleloParalelo CDGE CDGE TTGE TTGE Métodos Baseados na conformação Métodos Baseados na conformação SSCP SSCP HA HA CSGE CSGE

3 Melting Profiles Vários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total

4 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Gradiente de desnaturação Químico Temperatura O gradiente pode ser: Perpendicular ao campo eléctrico Paralelo ao campo eléctrico

5 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) heteroduplexes homoduplexes

6 Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)

7 Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão

8 Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) Vantagens Mais fácil de fazer os geis Mais fácil de fazer os geis Mais reprodutível de gel para gel Mais reprodutível de gel para gel Desvantagens Mais difícil de acertar a gama de Tm

9 HR-1 High Resolution Melter 0.01ºC/s a 1ºC/s Tambiente a 100ºC 24bit Fluorescence 24bit Temperature 5-20µL Volume amostras/h (0.3ºC/s) LCGreen I Excitação a nm Emissão a nm

10 HR-1

11 Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNA Conformação do dsDNA não depende da sequência não depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de mismatch A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de mismatch Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência) depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)

12 Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturado dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido dsDNA é diluido Renaturação rápida Renaturação rápida Corrida em condições semi- desnaturantes e a temperaturas fixas Corrida em condições semi- desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) WT1 WT2 mutantes

13 Heteroduplex Analysis (HA) Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformação Distorção na conformação Migração no gel mais lenta Migração no gel mais lenta Heterodupletos podem existir por: Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotos Co-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M

14 Heteroduplex Analysis (HA) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA

15 Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio: Principio: Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. Método: Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnaturante) Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnaturante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como crosslinker, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Pode utilizar-se BAP ou PDA como crosslinker, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com bp Utilizar fragmentos com bp

16 DHPLC Coluna Hidrofóbica Coluna Hidrofóbica Interacção entre coluna e DNA efectuado pelo Acetato de Trietilamónio (TEEA) Interacção entre coluna e DNA efectuado pelo Acetato de Trietilamónio (TEEA) Libertação da retenção efectuada por um gradiente crescente de Acetonitrilo (ACN) Libertação da retenção efectuada por um gradiente crescente de Acetonitrilo (ACN) ssDNA menos retido que dsDNA ssDNA menos retido que dsDNA

17 DHPLC Perfil de utilização dos Tampões BRCA1

18 Transgenomics DHPLC Wave Systems Plus 3500HT Microbial

19 Hibridização desnaturar

20 Hibridização Adicionar sonda

21 Hibridização

22

23 Dot-Blot

24 Variações Hibridização em microplaca Hibridização em microplaca hibridização reversa hibridização reversa

25 DEIA (hibridização reversa em microplaca) (detecção com anti-dsDNA)

26 Inno-Lippa Hibridização em filtro Hibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Hibridização reversa Hibridização reversa Marcação no produto do PCR Marcação no produto do PCR

27

28 Resultados do INNO-LIPA

29 MEIA

30

31 Southern Blot

32

33 Northern Blot Semelhante ao Southern Semelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNA Utiliza RNA e não DNA Não utiliza reacções de restrição Não utiliza reacções de restrição

34 Hibridização em microchip Miniaturização de um dot-blot Miniaturização de um dot-blot Densidade variável Densidade variável Hibridização automática Hibridização automática Leitura automática Leitura automática

35 Hibridização em microchip: procedimento

36 Hibridização em Microchip: Staph-A (1)

37 Hibridização em Microchip: Staph-A (II)

38 Hibridização em Microchip: Coagucheck Marcadores para factores de risco de trombose Marcadores para factores de risco de trombose


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