Estudo de doenças Auto-imunes

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1 Estudo de doenças Auto-imunes
Doenças Autoimunes endócrinas Prof.Doutor José Cabeda

2 Patologias autoimunes sistémicas e de órgão
LES Lúpus discóide Esclerodermia Citopenias autoimunes Síndrome de Goodpasture Cirrose Biliar Primária Hepatite crónica activa Síndrome Guillain-Barré Uveite Fibrose Pulmonar Idiopát. Artrite reumatóide Artrite reumatóide juvenil Sindrome de Sjögren DMID (Diabetes ) Psoriase Doença de Graves Doença de Hashimoto Esclerose Múltipla Colite ulcerosa Doença de Chron Miastenia Gravis Prof. Doutor José Cabeda

3 Doenças Autoimunes endócrinas
Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto) Doença de Graves Diabete Melitus dependente de Insulina Doença da Addison Prof. Doutor José Cabeda

4 Auto-antigénios de Doenças Autoimunes endócrinas
Tiroidite crónica Tiroglobulina Peroxidase da Tiroide (TPO) Doença de Addison Antigénios Adrenais Ovario, Testiculos, Placenta (uso em investigação) Hipoparatiroidismo Antigénios da paratiróide (Ag citoplasmáticos) Anemia Perniciosa Células parietais gástricas (subunidades a e b da ATPase H/K) Doença de Graves TSH-R (Receptor da Hormona pituitária tirotropina ) TSAb imita a acção da TSH TBAb bloqueia a acção da TSH (existe no hipotiroidismo) Testar a presença com células RFTL-5 ou substituto Prof. Doutor José Cabeda

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Diabetes Mellitus Causada pela destruição das células beta do pâncreas, mediada por células T Estudo da função celular T não é prática Presença de Autoanticorpos é marcador da doença Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios das células beta, devido à sua destruição Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com a evolução da doença Testados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISA Prof. Doutor José Cabeda

6 Auto-antigénios na IDDM
Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA) Existem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novo Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD) Bandas de 64Kd e 50Kd Insulinoma Antigen (40 e 37Kd) IA-2 IA-2b GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes) Anti insulina (IAA) Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novo Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a probabilidade de o doente possuir IDDM Prof. Doutor José Cabeda

7 Auto-antigénios na IDDM
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8 Estudo de doenças Auto-imunes
Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso Prof.Doutor José Cabeda

9 Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso
Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto-anticorpos Miastenia Gravis Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na membrana pós-sináptica do musculo Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES) Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado pela voltagem, que regula a libertação do transmissor no terminal nervoso do músculo Prof. Doutor José Cabeda

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14 Estudo de doenças Auto-imunes
Anemia Hemolitica Autoimune Prof.Doutor José Cabeda

15 Anemias Hemoliticas autoimunes
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16 Anemias Hemoliticas autoimunes: Técnicas diagnósticas laboratoriais
Direct Antiglobulin Test (DAT) Demonstra o “coating” dos RBC com Ab in vivo Usado para investigar : Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA) Hemólise induzida por drogas Doença Hemolitica do recém-nascido Reacção aloimune á transfusão Em WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estável Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação atinge zonas mais quentes Em PCM (semelhante ao CAD mas com IgG sangue coag. Activ. complemento  falsos positivos Prof. Doutor José Cabeda

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DAT: procedimento Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento) Preparar RBC (2-4%) em PBS 1 gota RBC em 3 tubos (aIgG, aC3b/C3d, e albumina como controlo) Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm) Adicionar 2 gotas de aIgG, aC3b/C3d, e 6% albumina Misturar e spin o tubo com aIgG 15’’-3400rpm Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e microscópicamente para a presença de aglutinação Incubar 5 min-RT os restantes tubos Repetir 6 e 7 para os restantes tubos Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio) a cada tubo negativo Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10 Em Indivíduos recentemente transfundidos separar os eritrócitos transfundidos (mais densos) por centrifugação. Se existir AIHA ambas as populações apresentam DTA positivo. Se apenas 1 população for positiva trata-se de Reacção transfusional tardia. Prof. Doutor José Cabeda

18 Eluição de anticorpos de RBC
Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas especificamente) Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH (promove a dissociação dos anticorpos) Centrifugar Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos Neutralizar o sobrenadante com solução tamponada Prof. Doutor José Cabeda

19 Determinação de amplitude térmica de auto-anticorpos
Cold reactive Ab reagem a 0-4ºC Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC Colher e manter amostra a 37ºC Spin 3400rpm-1min Incubar 5’ a 37ºC 1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC Agitar; incubar 1 hora a 37ºC Spin 15’’-3400rpm e examinar macroscópicamente Repetir 5 e 6 a 30ºC Repetir 5 e 6 a 22ºC Pos a 30 e 22ºC  Ig patológicas Pos só a 22ºC Cold aglutinin A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA Prof. Doutor José Cabeda

20 Indirect Antiglobulin Test (IAT): (Antibody screen for RBC-Ab)
Routine pre-transfusion test Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados para aglutinação em 2 fases: 37ºC com agente “enhancer”* Após adição de a-IgG (reagente coombs) Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os falsos positivos devidos a alo-anticorpos WAIHA geralmente pan-RBC * BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente) Prof. Doutor José Cabeda

21 Quantificação de alergénios
Estudo de Alergias Quantificação de alergénios Prof.Doutor José Cabeda

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Estudo de Alergias Estudos in-vivo Prof.Doutor José Cabeda

23 Quantificação de Alergénios
Skin testing Protein content Quantificação de alergénios individuais (RIA,ELISA, etc) Imunoelectroforese PAGE Imunobloting Inhibition immunoassays Prof. Doutor José Cabeda

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Skin testing Para controlar a possibilidade de choque séptico Médico disponível em SOS Garrote disponível em SOS 1 mg epinefrina disponível em SOS Seringa hipodérmica com 100 mL alergénio Injecção de mL, cerca de 3mm diâmetro Observação aos 15 min Medir dois diâmetros e calcular média Nova observação aos 30 min Prof. Doutor José Cabeda

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Skin testing Prof. Doutor José Cabeda

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Estudo de Alergias Testes Laboratoriais Prof.Doutor José Cabeda

27 Testes laboratoriais para estudo de alergias
Determinação de IgE total Determinação de IgE específica para um alergénio Screening multialergénico Imunoblotting com alergénios Medida de alergénios caseiros Skin testing Prof. Doutor José Cabeda

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29 Determinação de IgE total
Captura com aIgE conjugada com suporte sólido Lavar Reagir com aIgE marcada Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) Prof. Doutor José Cabeda

30 Determinação de IgE específica para um alergénio
Alergénio ligado a matriz sólida Adicionar soro doente Incubar e lavar Reagir com aIgE marcada Lavar Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) Prof. Doutor José Cabeda

31 Multiple Alergen Screens
Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida Ex: Mistura de árvores Mistura de relvas Mistura de sementes Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust mites Pelo de cão e gato Etc... Prof. Doutor José Cabeda

32 Specific IgE Inhibition immunoassays
Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em diluições sucessivas Usar PBS como 0% inibição Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro do doente e incubar 2 horas com agitação Alergénio ligado a suporte sólido Fazer um ensaio de detecção de IgE específica Calcular a % inibição para cada diluição do inibidor Fazer um plot da inibição em função da concentração de inibidor Prof. Doutor José Cabeda

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