Prof.Doutor José Cabeda

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1 Prof.Doutor José Cabeda
Apoptose 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

2 Apoptose Apoptosis=grego para ‘falling off’ (Caír, desfazer)
Processo fisiológico de morte celular programada Processo activo Inibição deste processo é activa e altamente regulada Fases: A Célula Compacta-se A membrana forma invaginações A cromatina condensa O DNA Fragmenta-se A célula morta divide-se em vesículas membranares (corpos apoptóticos) que são fagocitados

3 Os processos bioquímicos da apoptose
Proteólise Fragmentação genómica Perda de assimetria da membrana celular Fragmentação celular

4 Apoptose versus Necrose
Determinada genéticamente Ocorre dentro dos intervalos fisiológicos Célula compacata-se Resulta de diversos passos intrinsecamente regulados Participa no equilibrio homeostático do organismo Fenómeno individual celular (suícidio celular) Nunca ocorre perda de estanquicidade membranar As vesículas formadas são removidas por fagocitose, num processo muito rápido que não deixa vestígios Necrose Determinada genéticamente Resulta da alteração súbita de um ou mais intervalos fisiológicos (pH, Temperatura, [iónicas], etc) Citoplasma “incha” Resulta da inviabilização metabólica da célula Não tem funções homeostáticas Fenómeno colectivo a todas as células vizinhas Resulta na perda de estanquicidade da membrana O derramamento do fluido celular inicia processos tecidulares (inflamação) que duram horas ou dias e originam marcas duradouras (cicatrizes)

5 Controlo da apoptose A apoptose em condições biológicas é uma resposta celular a variações subtis no meio extracelular Na membrana citoplasmática No interior da célula O mesmo estímulo pode desencadear apoptose num tipo de célula, ser inócuo noutro, e desencadear a proliferação noutro A resposta de um tipo de célula a um dado estímulo pode ser variável pois depende de outros factores celulares (ex:fase de maturação) e ambientais (outros estímulos)

6 Funções da apoptose Moldar os tecidos na embriogénese
Eliminar células alteradas (ex. cancro) Eliminar células que deixaram de ser necessárias (ex. Sistema Imunológico)

7 Programmed Cell Death A. Form digits B. Form lumina
C. Vestigal structure D. Mullerian/Wolffian E. Cull extras (neurons)* F. Cull immune system* G. Cull damaged cells* *focus of many studies

8 Anomalias da apoptose Malformações congénitas
Doenças Neurodegenerativas Disfunções imunológicas Tumores

9 Apoptose em patologias
Cancro Inibição da apoptose HPV inactiva o promotor do p53 EBV aumenta a produção de bcl-2 Algumas Leucemias B expressam níveis elevados de bcl-2 Melanoma inibe a expressão de Apaf-1 Alguns tipos de cancros do pulmão e do colon secretam uma proteína que bloqueia o FasL Alguns tipos de tumores expressam níveis elevados de FasL induzindo apoptose nas CTL que com elas interactuam Doenças Auto-imunes Defeitos na indução de apoptose Defeitos na selecção celular Dificuldade em desligar as respostas imunológicas Imunodeficiências Excesso de apoptose Deficiências na selecção positiva

10 Regulação da apoptose Estudos em Caedorhabditis elegans permitiram identificar 4 grupos de genes: Responsáveis por desencadear a apoptose Genes envolvidos no processo apoptótico Genes necessários para a fagocitose dos corpos apoptóticos Genes necessários para a dissolução final dos corpos fagocitados bloqueio Ced-9 detonação apoptose fagocitose dissolução Egl-1, ces-1, ces-2 Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11 Ced-1,ced-2,ced-5, ced-6, ced-7, ced-10 Nuc-1

11 Apoptose em mamíferos detonação apoptose fagocitose dissolução
bloqueio Ced-9 detonação apoptose fagocitose dissolução Egl-1, ces-1, ces-2 Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11 Ced-1,ced-2,ced-5, ced-6, ced-7, ced-10 Nuc-1

12 A Família bcl-2 BH= bcl-2 homology domain Three subfamilies
Formação de homo/hetero-dimeros Promoção da apoptose Na ausência de BH1 e BH2 Ligação a proteínas de outras famílias Ancoragem à membrana Three subfamilies Bcl-2 (survival, 4BH) Bax (apoptosis, 3BH) BH3 only (apoptosis) BH= bcl-2 homology domain

13 Apoptose mediada por sinais internos à célula
A membrana da mitocondria contém bcl-2 ligado a Apaf-1 Dano interno provoca: Dissociação entre o bcl-2 e Apaf-1 Saída de cyt-c para o citoplasma O cyt-c e o Apaf ligam-se a caspase-9 formando o apoptosoma (com ATP) Os apoptosomas agregam, a caspase-9 inicia uma cascata de activação de caspases por proteólise Degradação de proteínas estruturais do citosol Degradação do DNA nuclear

14 Apoptose mediana por sinais externos à célula
Fas e o receptor do TNF são proteínas de membrana constitucionais A ligação de FasL e TNF induz: Activação de caspase 8 Inicia a cascata de activação de caspases Degradação de proteínas estruturantes Degradação do DNA nuclear

15 Apoptotic Pathways Extrinsic pathway the death machinery is triggered by death ligands interacting with DRs to activate initiator caspases. Intrinsic pathway centers on mitochondria which release cyto-c into the cytosol activating caspase cascade. The extrinsic and intrinsic death pathways can operate singly but crosstalk between the pathways occurs at many levels. Cyto-c binds Apaf-1 in turn binds to procaspase-9 and activates it and the cascade. Smac/DIABLO released from mitochondria can bind to IAPs overcoming their inhibition on various caspases. The extrinsic and intrinsic death pathways are linked by the cleavage of Bid by caspase-8. Cleaved Bid translocates to mitochondria and induces Bax/Bak-dependent release of mitochondrial proteins.

16 Death Receptors Modular Structures
CRD=cysteine rich extracellular domain DD=cytoplasmic death domain Adapters/FADD,etc contain DDs to interact with receptors and transmit apoptotic signal to machinery Receptors have unique features to recognize ligand with specificity TNFR1/TNF-a, lymphotoxin alpha Fas (CD95)/FasL, DAXX DR3 & DR4/TRAIL Not Death Receptors Other TNF members, B & T cell antigens, lack DDs

17 Executioners of Apoptosis

18 Caspases: A Common Pathway
Caspases are proteases involved in 2 stages of the apoptotic pathway Caspases are synthesized as inactive procaspases that are activated by cleavage to form the active dimer A complex forms at the receptor that activates caspase-8 to ‘initiate’ the pathway

19 Caspase Activation Synthesized as single chain precursor
Cleavage site at conserved Asp-297 N-peptide contains death-effector domain required to recruit the death receptors (DRs) to the cytosolic face

20 Caspase Family Members
Structural features CARD (caspase recruitment domain DED (death effector domains) for adaptors Caspase cleavage Site separates subunits Substrate cleavage caspase cleaves motifs (P1-P4 )in substrates

21 Pro-apoptotic regulators promote caspase activation
Figure 23-50

22 Some trophic factors prevent apoptosis by inducing inactivation of a pro-apoptotic regulator
Figure 23-50

23 Death Machinery Initiators of cascade caspases-1,-8, -9, -10
Effectors of cascade caspases-2, -3, -6, -7 Proteins cleaved during execution phase of apoptosis (eg, PARP, lamin A) for irreversible cell death decision

24 Cysteine Aspartate-specific Proteases
Caspase Substrates Cleavage motif Caspase pro-IL-1beta YVHD-A Caspase PARP DEVD-G* DNA-PK DEVD-N Rb DEAD-G Caspase all other pro-caspases Caspase PARP DEVD-G* procaspase-3 DEVD-G*

25 Caspase Inhibitors Defining motif BIR= baculovirus IAP repeat
Multiple BIR domains CARD for caspase recruitment domain RING domain homolog of ubiquitin E3 adaptors

26 Caspase Inhibitors FLIPS (FLICE inhibitory proteins)
IAPs (inhibitors of apoptosis) BIR motif necessary/sufficient for anti-apoptotic activity XIAP, cIAP1, cIAP2 inhibit processing of procaspases-3, 6, 7 by inhibiting cytochrome-c induced activation of caspase-9 FLIPS (FLICE inhibitory proteins) Contain 2 death effector domains (DEDS) DEDs interfere with FADD/caspase-8 interaction and activation Block early events of other death receptors (TNFR1,TRAIL/DR4) Peptide inhibitors Synthetic peptide sequences based on substrate binding pocket motif in positions P1-P4 (Ac-YVAD-cho, c-DEVD-cho)

27 Apoptotic Pathways Converge: Role of Bcl-2 Family
Extrinsic Pathway: Ligation of receptors Adaptor recruitment Activation of caspase-8 Transmit death signal Intrinsic Pathway: Cellular stress (x-ray/drug) Mitochondria integrator Bcl-2 family regulators Activation of caspase-9

28 The Bcl-2 Family Mechanism of Action
Bcl-2/Bcl-XL/Apaf-1 BH4 of Bcl-2 & Bcl-XL bind to C-term of Apaf-1 inhibiting binding to Casp-9 Bcl-2 and cyto-c Bcl-2 directly or indirectly prevents release of cyto-c from mitochondria Bid of BH3 family mediates release of cyto-c c/o PT Bax death pathway BH1 and BH2 form pores Death caspase independent

29 Summary of Bcl-2 Family Roles

30 Mitochondrial dysfunction
Many apoptotic stimuli use mitochondrial dysfuntion to signal apoptosis (intrinsic cues) Steroids Drugs (DNA damage) Irradiation (redox imbal) Loss of growth factors Ceramide generation Distinct ‘BH3 only’ proteins respond to specific death stimuli Activated BH3 proteins translocate to mitochondrial surfaces to associate with Bcl-2 related proteins to form membrane-spanning pores Cytochrome c release induces formation of the apoptosome, a ternary complex of cyto-c, Apaf-1 and caspase-9 Apoptosis disrupts mitochondrial membrane potential PT (permeability transition)

31 Mitochondrial Permeability Transition
Effectors of PT Divalent cations Ca2+ ROS and nitric oxide Conc of some peptides (transport signal sequens) Lipid mediators Any major change in energy balance (ATP, NAD) or redox state PT functions to integrate stress responses and any major damage of cells will trigger PT. PT itself causes change in energy and redox balance, when massive, can lock the cell into irreversible stage.

32 Permeability Transition Pore
Bcl-2 family members control PTP channel Bcl-2 proteins in membrane of mitochondria PTP a large pore induced by necrotic or apoptotic signals OM, outer membrane IM, inner membrane IMS, inner membrane space PT is achieved by H+ ion gradient generated by electron transport. The H+ gradient is used by the FoF1 synthase to synthesize ATP. Opening of PTP results in mitochondrial depolarization, uncoupling of oxidat phosphorylation and swelling of mitochondria Direct association between Bax and ANT or Bax and VDAC have been proposed

33 Role of Mitochondria in Apoptosis
Releases pro-apoptotic molecules into cytosol upon death stimuli Apoptosome is formed (Cyto-c,Apaf-1, casp-9) Opening of PTP can release procasp-2 or -9 Bcl-2 (tethering protein) can regulate activation of mitochondrial pool

34 Summary of the Players Death Pathways Triggering stimuli Caspases
Bcl-2 family Mitochondria Death by apoptosis vs necrosis

35 Prof.Doutor José Cabeda
Oncologia 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

36 CANCRO: UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS
A origem genética dos tumores Proto-oncogenes e oncogenes Factores de crescimento Receptores para factores de crescimento Transdutores intracelulares de sinal Factores de transcrição nuclear Proteínas de controlo do ciclo celular Genes de Supressão tumoral Os carcinogénios como mutagénios Agentes virais na origem dos tumores Oncogenes virais Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes Activação de proto-oncogenes Amplificação de proto-oncogene A "estatística" na origem dos tumores

37 Proto-oncogenes e Oncogenes
Genes normais que depois de alterados por mutação originam um fenótipo tumoral Fazem parte do património genético de todos Oncogenes Gene resultante da alteração de um proto-oncogene, e que causa um fenótipo tumoral Fazem parte do património genético das células transformadas

38 Receptores para factores de crescimento

39 A GENÉTICA MOLECULAR EM HEMATO-ONCOLOGIA
CANCRO: UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS A origem genética dos tumores Proto-oncogenes e oncogenes Factores de crescimento Receptores para factores de crescimento Transdutores intracelulares de sinal Factores de transcrição nuclear Proteínas de controlo do ciclo celular Genes de Supressão tumoral Os carcinogénios como mutagénios Agentes virais na origem dos tumores Oncogenes virais Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes Activação de proto-oncogenes Amplificação de proto-oncogene A "estatística" na origem dos tumores ANOMALIAS GENÉTICAS EM HEMATO-ONCOLOGIA Translocações cromossómicas em hemato-oncologia Translocações envolvendo genes das Ig ou TCR translocação t(8;14)(q24;q32) e o EBV A t(14;18) - BCL2/IgH Translocações que originam genes hibridos t(9;22) - bcr/abl t(15;17) - pml/rar Delecções cromossómicas em hemato-oncologia Mutações pontuais em hemato-oncologia mutações no gene p53 UTILIDADE CLÍNICA DA GENÉTICA MOLECULAR EM HEMATO-ONCOLOGIA Aprofundamento de conhecimentos Escolha de tratamentos específicos Monitorização da doença

40

41 Transdutores intracelulares de sinal

42 Factores de transcrição nuclear

43 Proteínas de controlo do ciclo celular (ciclinas)
O ciclo celular é controlado por ciclinas (cdk), p53 e RB (entre outros factores) Permite uma sincronia entre o crescimento, duplicação de DNA e divisão nuclear Alterações nos genes das ciclinas podem originar fenótipo tumoral se: Ocorrer alteração da expressão de uma ou mais ciclinas se ocorrem mutações nas sequências codificantes dos genes que codificam as ciclinas, o p53 ou o RB

44 Genes de supressão tumoral
Genes que suprimem o desenvolvimento de tumores Mutações germinais associadas com predisposição tumoral Fenótipo dominante, mas recessivo ao nível celular (a >parte) O fenótipo depende da inactivação da cópia normal do gene (ex. Retinoblastoma-gene RB, um regulador do ciclo celular) Fenótipo dominante (casos raros) O p53 é um estimulador da apoptose que funciona como tetrâmero. Uma diminuição da concentração causada por uma mutação heterózigótica inibe a formação de tetrâmeros, causando um fenótipo dominante.

45 Os carcinogéneos como mutagéneos
Os mutagéneos são substâncias capazes de se interagirem com os ácidos nucleicos, modificnado-lhes propriedades Se as alterações genéticas resultantes ocorrerem em proto-oncogenes, genes de factores de crescimento, ou genes de supressão tumoral, o genótipo resultante pode ser tumoral

46 Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes virais

47 Oncogenes virais

48 Activação e amplificação de proto-oncogenes

49 Translocações envolvendo os genes TCR e Ig

50 Linfoma de burkit t(8;14) - t(8;22) - t(8;2)
Origina a expressão do c-myc nos linfócitos B

51 Linfomas foliculares e difusos
Diagrama mostrando os cromossomas 14 e 18 normais, e os cromossomas resultantes da translocação t(14;18)(q32;q21), envolvendo os genes BCL-2 (18q21) e IgH (14q32).

52 Genes hibridos resultantes de translocções

53 Bcr/abl Os genes BCR e ABL normais, e as translocações que originam as proteínas p190 e p210 do gene quimera BCR-ABL. A proteína p210 é característica da CML, sendo a p190 a proteína BCR-ABL encontrada na maioria dos casos de ALL

54 pml/rar A localização cromossómica e estrutura normal dos genes PML e RARa, e a translocação t(15;17)(q22;21) que origina o gene quimera PML-RARA.