Polymerase Chain Reaction PCR Polymerase Chain Reaction

Idealizada por Kary Mullis, ~1980 Explora características do processo de replicação do DNA DNA polimerase usa o DNA como molde para síntese de uma nova fita complementar DESNATURAÇÃO ANELAMENTO POLIMERIZAÇÃO

Etapas da reação de PCR 1. Desnaturação: 94 ° C - 96 ° C Separação das fitas 2. Anelamento: 37 ° C - 65 ° C Iniciadores se anelam a sítios específicos nas fitas simples de DNA 3. Extensão: 72 ° C DNA polimerase usa dNTPs para formar fita complementar a fita molde  POLIMERIZAÇÃO 5’  3’

Após sucessivos ciclos

Componentes da reação tampão

Tampão Mantém pH ótimo para atividade da enzima Sais Força iônica para atividade máxima da enzima Influencia na cinética de hibridização das moléculas de DNA Mg2++ (0,5 – 4 mM) Afeta anelamento dos iniciadores Temperatura de dissociação do molde Especificidade do produto amplificado Atividade e fidelidade da enzima

Tm = 4 * (G’s + C’s) + 2 * (A’s + T’s) dNTP´s ( 20 – 200 uM) Influencia o rendimento do produto final, especificidade e fidelidade da reação Iniciadores (0,1 – 0,5 uM) Tm  temperatura de anelamento Temperatura de Anelamento estimada para iniciadores < 20 bases: Tm = 4 * (G’s + C’s) + 2 * (A’s + T’s) Tanneal = Annealing temperature = Tm - 5° C

Fidelidade da Reação

DNA polimerase Taq polimerase  DNA polimerase termoestável DNA- dependente isolada de Thermus aquaticus Taxa de erro: 8,9 x 10 -5 a 1,1 x 10 -4 Enzima recombinante  Taq DNA polimerase modificada Associada a um anticorpo que é inativado na etapa de desnaturação do primeiro ciclo da PCR Aumenta a sensibilidade, especificidade e rendimento da reação Exemplos: TaqStart, ThStart (Clontech), Platinum Taq Polimerase (Life Technologies)

Desenho de iniciadores 15 – 30 nucleotídeos Pareamento na região 3´é crítico Checar estruturas secundárias internas Evitar complementaridade dos iniciadores na região 3´ (formação de dímeros)

Cinética da PCR Fase de “screening” - ciclos iniciais Iniciadores “procuram” a seqüência complementar no DNA molde Fase intermediária Amplificação Pareamento do iniciador é facilitado por terem várias cópias da seqüência alvo Fase tardia ou fase de platô Limitação dos reagentes Competição dos produtos gerados com iniciadores disponíveis SATURAÇÃO

Causas do platô Perda da atividade da enzima Enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA Acúmulo de produtos amplificados tendem a parear entre si (Aumenta possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos) Falta de reagentes Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor, mas também foram se acumulando, etc…

Diferentes aplicações da técnica de PCR Amplificar seqüências específicas de DNA Detecção de mutações Detecção de doenças virais e bacterianas Acompanhamento do tratamento de câncer Determinação de sexo em células pré-natais Estudo de evolução molecular

A PCR é o principal método utilizado na detecção e quantificação de alimentos contendo OGMs. método sensível, específico, seguro, capaz de detectar uma ampla série de eventos e de distinguir as variedades GM que apresentam diferentes construções gênicas, porém expressam a mesma proteína . O limite de detecção da PCR está entre 20 pg e 10 ng de DNA alvo, correspondendo a 0,0001 a 1% de OGM, o limite de detecção é menor do que vinte moléculas de DNA alvo. Ciência Rural, v.36, n.1, jan-fev, 2006.

Principais limitações da PCR: dificuldade na construção dos iniciadores, uma vez que a informação sobre a seqüência da modificação genética geralmente é confidencial, necessidade de pessoal treinado e equipamentos especiais, elevado custo, pois cada teste é específico para uma única modificação genética, necessidade de material de referência certificado, cuja disponibilidade geralmente é limitada, eventuais contaminações.

A vantagem desta estratégia é a elevada especificidade Entre as principais técnicas de detecção qualitativa e de rastreamento estão a PCR qualitativa, a PCR nested e a PCR multiplex. PCR nested consiste no uso de dois pares de iniciadores para um determinado evento de OGM. O primeiro par de iniciadores amplifica uma seqüência específica do DNA alvo, que servirá de molde para o segundo par de iniciadores (nested). A vantagem desta estratégia é a elevada especificidade A PCR multiplex é uma técnica rápida e confiável que possibilita a detecção de várias seqüências de DNA alvo em uma única reação,resultando na economia de tempo e reagentes.

qRT-PCR – PCR em tempo real – análise dos produtos da PCR durante a amplificação A PCR-TR é altamente sensível, precisa, sensível, precisa, segura, rápida e capaz de detectar uma ampla série de eventos. eventos GM. Além disso, o produto da reação é o produto é analisado diretamente no tubo, reduzindo significantemente o risco de contaminação principais limitações: necessidade de equipamentos especiais e dispendiosos padrões de calibração definidos insumos caros baixa reprodutibilidade A sensibilidade da qRT-PCR é de aproximadamente 0,01% de OGM

RT-PCR Amplifica cópias de cDNA a partir de RNA; Utilizada para: clonagem de terminações 5’ e 3’ dos mRNAs; gerar bibliotecas de cDNA; - Medir intensidade da expressão do gene quando o mRNA é limitado ou o RNA de interesse é expresso em níveis baixos.

Transcriptases reversas AMV: avian myeloblastosis virus (causa anemia em aves) e Mo-MLV: Moloney strain of murine leukemia virus (causa leucemia linfóide em camundongos) requerem amostra de RNA ou DNA com iniciadores de RNA ou DNA na extremidade 3’. Não possuem atividade exonuclease 3’->5’ Necessita de  [dNTP] Apresentam atividade RNase H Mo-MLV: atividade Rnase H fraca e alcança atividade máxima em baixas temperaturas

Transcriptases reversas Variantes de Mo-MLV Ex: Superscript, StrataScript Não possuem atividade RNase H Sintetizam moléculas de cDNA mais longas do que o tipo selvagem Transcrevem grande proporção de amostras Capazes de sintetizar cDNA em  temperaturas

Sambrook, Russell